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1、肿瘤坏死因子摘要 恶性肿瘤疾病目前仍是全世界需要共同面对的一种医学难题，其发病隐匿,初期容易被忽视，而临床患者多数已到中晚期,此时的疾病已很难治疗。肿瘤坏死因子是一种能使肿瘤出血,并能克制、杀伤体外培养的肿瘤细胞的蛋白类物质，1984年NF基因的克隆开辟了临床实验的时代,是第一种用于肿瘤生物疗法的细胞因子,但因其缺少靶向性且有严重的副作用，对该基因的研究和应用形成了很大的障碍,目前诸多研究人员正致力于该基因改造与应用。核心词 NF、肿瘤1 TF的生物学特性TNF按其构造可以分为两种：T和TF。T是一种单核因子,重要由活化的单核细胞和巨噬细胞产生,T是一种淋巴因子,由活化的T细胞和NK细胞产生,
2、目前研究多为TNF。人的TN位于第6号染色体短臂上，与HC紧密连锁1，人的TN基因大小为276b，由4个外显子和3个内含子构成。TN的蛋白质构造有多种形成，有二聚体、三聚体、五聚体，其中有生物活性的是三聚体。位于TNF的5端，同样由4个外显子和个内含子构成，其中第4个外显子与TNF高度同源,编码%-90%的成熟蛋白质。 F的来源与体现TNF在人体内的来源途径有诸多,如单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞、成纤维细胞等都可以在一定的条件下产生和释放TF。目前觉得F重要的生物合成场合有心、肝、肺、肾2。多种外来刺激如内毒素脂多糖(LP）、肠毒素、霉菌抗原、某些寄生虫的溶解物、病毒颗粒等,均可以引起TF的体
3、现与释放。在正常状况下,TF只由心肌间质的巨噬细胞产生,在某些病理状态下，如感染或内毒素的刺激下,心脏可以产生TNF,Giroir等研究证明这一点,在这些应激状态下，成熟的心肌细胞同样可以产生TNmN及其蛋白质，且产生的量同巨噬细胞产生的差不多。Kleie等4证明,在生理状态下，脑内在构造和功能方面与巨噬细胞相似的细胞如神经元、小胶质细胞、血管内皮细胞均可合成分泌TNF、I-6等细胞因子。在炎症状况下,这些细胞因子的水平明显升高,且对中性粒细胞有明显趋化作用5。有研究表白,有大概20%的恶性肿瘤的发生与慢性炎症有关6。 T受体通过对TF分子一级构造的研究表白,C末端在TNF的生物学活性中起决定
4、性作用。由于-末端参与TNF高档构造的构成，只要切掉个氨基酸就可使TNF丧失生物学活性。而N-末端的变化范畴较大,合适变化其长度并不影响其生物学活性，末端还与TF对受体的结合能力密切有关，也许为与受体结合的部位。TF生物学效应的发挥，有赖于其与靶细胞上的TFR相结合,并通过受体后效应将信号传至胞核。NFR存在于多种细胞表面，肿瘤细胞表面同样也存在TFR，不同细胞表面上受体的数目以及亲和力均有所不同,且这些差别不呈平行关系。TNF受体可分为种,即TR和TFR,两类TFR均为糖蛋白,两类受体胞外区域氨基酸序列相似度很高，但胞内区域则完全不同。由于多种细胞体现NFR存在差别，使得TNF对多种细胞的作
5、用不同,一般来说,受体数目越高越容易受到TNF的损伤。TNF还存在2种可溶性形式,为从细胞膜上通过蛋白酶水解下来的受体片段。它们通过与TNF结合而影响NFR和TNF的功能及其含量变化，且影响效果是明显的。采用表面等离子体共振技术研究表白,F与其可溶性受体的亲和常数远高于一般的抗原与抗体结合的亲和力8。4 TNF的生物学活性 TNF在体内、体外均能杀死某些肿瘤细胞,或克制其增殖作用。TNF杀伤肿瘤的机理还不十分清晰，与补体或穿孔素杀伤细胞相比,TF杀伤细胞没有穿孔现象,并且杀伤过程相对比较缓慢。NF可以增长过氧化物阴离子产生,增强CC功能，刺激细胞脱颗粒和分泌髓过氧化物酶,增进中性粒细胞粘附到内
6、皮细胞上，从而刺激机体局部炎症反映。NF增进细胞MHC类抗原体现，增强I-2依赖的胸腺细胞、T细胞增殖能力,增进IL-、CS和IFN-等淋巴因子的产生，增强有丝分裂原或外来抗原刺激B细胞的增殖和Ig分泌。5 TN与临床 TF是目前发现的抗肿瘤活性最强的细胞因子。在许多疾病,如心血管疾病、恶病质和败血症休克所致的多器官功能衰竭、类风湿性关节炎、多发性硬化症、炎症性肠病、移植物抗宿主病和骨髓造血紊乱综合症等的病理生理过程中起着重要的作用9。N除了对肿瘤细胞自身具有细胞毒性之外,它也能摧毁实体瘤周边的血管上皮组织，并且通过血栓的形成，阻断肿瘤的血液营养供应，最后导致肿瘤的出血性坏死、消退或消失。超过
7、一定浓度的TNF具有明显的抗新生血管形成作用。TNF能明显减少实体瘤周边间隙组织的压力，扩大肿瘤周边上皮组织的间隙,变化周边血管的通透性，使化疗的药物达到靶组织周边。此外,TNF通过对人体免疫系统的调节从而加强自身的抗肿瘤作用。TNF导致的心肌机能障碍涉及钙平衡的变化、直接的细胞毒作用、氧化张力、兴奋-收缩耦联破坏、心肌细胞凋亡等。 研究表白,严重的充血性心力衰竭、心肌梗死、心肌炎、扩张性心肌病、心脏移植排斥反映和进行心肺旁路手术患者的血浆TNF水平明显升高。 NF的制备 常用制备TNF的措施有体内法、体外法和基因工程法。体内法将卡介苗和PS注入实验动物体内,诱导体内TNF的产生。外周血单个核
8、细胞在重组白介素2和有丝分裂原刺激下,或在十四酰沸波乙酸酯和L作用下均能产生N，此法可在体外大量收集细胞培养物,实现批量生产。分子生物学技术的应用，极大的增进了人TNF的制备工作。人N的氨基酸序列已弄清晰，并克隆出编码TNF蛋白质的cN。运用基因工程法可获得高活性、高纯度的F。基因工程法制备1) 改造TF的分子构造分析hF的空间构造是研究新型TNF的前提。具有生物活性的hTNF其空间构造是3个TN单体以边对面形式形成的近似三角锥形的三聚体,构造与功能研究表白，删去端前个氨基酸残基不影响hTN三聚体空间构造。相反，在删去N端个氨基酸的同步增长N端的碱性氨基酸，可以增强形成活性三聚体的能力，从而提
9、高NF的抗肿瘤活性1。何晓龙等11构建了种TNF的衍生物。这三种衍生物比以往报道的单独缺失端氨基酸或单独增强端碱性氨基酸引起的活性升高要大得多，阐明两种突变在提高TNF的细胞毒活性方面具有协同作用,具有潜在的临床应用前景。2) 制备T融合蛋白1. 具有TF抗肿瘤活性和靶细胞专一性的融合蛋白借助于细胞因子与其受体的特异性,TNF融合蛋白可以导向杀伤那些体现受体的肿瘤细胞。刘丽等12针对TNF在肿瘤治疗剂量下产生的严重毒副作用及某些肿瘤细胞白介素-受体明显增高的事实,采用PCR技术将TNF突变体与人IL成熟肽链编码区cDNA通过人工接头进行融合,并将融合的蛋白在大肠杆菌中体现,经活性检测成果证明，
10、该融合蛋白在具有TNF的对L29细胞和人骨髓瘤细胞的细胞毒作用和结合6受体的能力，在高体现IL-受体的人骨髓瘤细胞上测得的细胞毒活性教同样位点突变的TNF高约倍。国内比较成功的例子是抗肝癌单链抗体融合TNF的双功能抗体。陈波等将hNF同带有肝细胞特异结合位点的乙肝病毒表面抗原pre（1-6)肽段进行融合体现，并在融合蛋白之间加入了连接肽段或凝血酶酶切位点,获得了F与rS融合蛋白的体现产物，该产物具有T的对L2细胞的细胞毒活性。2. 具有双重活性的融合蛋白构建融合蛋白不仅要考虑其靶向性,还要增长其功能。IL-2和TNF是引人注目的抗肿瘤活性因子,两者在抗肿瘤及免疫调节方面具有协同作用。颜世庆等4
11、运用逆转录病毒载体构建了涉及编码L-2前导肽和F成熟肽序列的融合基因,体现的融合基因产物在体内和体外都对肿瘤细胞的生成具有克制作用。 高长寿等15将人降钙素基因有关肽与hTNF高效融合体现，体现的融合蛋白既有CGRP的结合活性，又有TF的活性。7 检测措施生物学检测措施:常用TNF对肿瘤细胞的细胞毒作用的强弱来判断它的活性。检测TF对靶细胞的细胞毒作用的指标重要有:胎盼兰活细胞计数法，中性红细胞摄入法,结晶紫染色法，TT法,荧光素标记法等。免疫学检测措施:免疫学检测重要是根据TNF分子自身具有抗原性的特点,与抗TNF抗体发生特异性结合,具有较高的敏捷度和特异性。与生物学检测相比,免疫学检测措施
12、由于不需要进行细胞培养,从而大大简化了操作过程,使得临床检测TNF成为也许。近几年基因工程的迅速发展,也为免疫学检测措施提供了大量高纯度的TN原则品。8 结语 TF是由激活的单核细胞、巨噬细胞产生的一种具有多种生物活性的多肽细胞因子，与机体免疫反映、急性期反映及炎症反映关系密切,它可通过激活细胞因子网络系统而诱发全身炎性反映,导致血液动力学变化、心肌克制、微血管损伤及急性肺 间质损伤等。运用对的合适的抗F治疗将也许成为一种新的治疗疾病的措施，但其临床应用价值尚有待于进一步的证明。参考文 献1 din GE,Nyo S,kagci A,et al. Human lmhotoxin ndchrom
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