液相色谱／质谱联用技术

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1、液相色谱/质谱联用技术 李立军色谱是快速灵敏分离有机物的有效手段，各种检测器中，除了应用最广泛的FID （GC） 和UV（LC）外，质谱（MS）尽管价格较昂贵，但是其选择性、灵敏度、分子量及结构信息 等优势，已被公认为高级的通用型检测器，把它与各种分离手段联用，将定性、定量结果有 机地结合在一起，一直是人们所研究的目标。GC/MS在我国已有20多年的应用历史，随着台式小型仪器迅速增长，在色谱研究中 已经成为重要的手段，气相色谱质谱技术成熟运用至今，人们越来越不满足仅仅分析那些具 有挥发性和低分子量的化合物，面对日益增加的大分子量（特别是蛋白，多肽等）和不挥发 化合物的分析任务，迫切需要用液相色

2、谱/质谱联用解决实际间题。与气相色谱相比，液相 色谱的分离能力有着不可比拟的优势，液相色谱/质谱联用技术为人们认识和改造自然提供 了强有力的工具。HPLC可以直接分离难挥发、大分子、强极性及热稳定性差的化合物，LC / MS联机曾长期为分析界所期待，由于LC流动相与MS传统电离源的高真空难以相容，还 要在温和的条件下使样品带上电荷而样品本身不分解，大量的样品不得不采取脱机方式MS 鉴定，或制成衍生物用GC/MS分析。经过努力相继出现了多种液相色谱/质谱联用接口， 实现了液相色谱/质谱的联用。特别是大气压电离质谱（APIMS）的实现为LC/MS的兼容 创造了机会，商品化的小型LC/MS作为成熟的

3、常规分析仪器在九十年代已经在生物医药实 验室发挥着重要的作用。一. 液相色谱/质谱联用适用范围液相色谱/质谱联用的基本流程为：混合的样品经高效液相色谱柱分离后成为多个单一 组分，依次通过液相色谱/质谱接口进入质谱仪的离子源，离子化后的样品经过质量分析器 分析后由检测系统记录，后经数据系统采集处理，得到带有结构信息的质谱图。样品分离质谱结果图1液相色谱/质谱联用的基本流程首先看看气相色谱/质谱联用的特点：要求样品气化后进入质谱仪用电子轰击方式（EI）得到的谱图，可与标准谱库对比用毛细管色谱柱分离化合物，分高效率高操作条件稳定、使用方法成熟适宜分析小分子、易挥发、热稳定的化合物液相色谱/质谱联用主

4、要可解决如下几方面的问题: 不挥发性化合物分析测定； 极性化合物的分析测定； 热不稳定化合物的分析测定； 大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多糖、多聚物等）的分析测定;附图清楚地表明了各种接口技术的适用范围。二.液相色谱/质谱接口的发展起步于70年代，先后研究出27种接口1. 传送带（MB） LC/MS接口方式七十年代末采用传送带方式与MS传统的EI, CI离子源相联。灵敏度差，不能用反相 柱，待测样品必须汽化后再电离。中国至少买了 8台，现已淘汰。2. 热喷雾（TS）产生于八十年代中期，不仅是LC/MS接口，也是软电离方式，热喷雾时LC流出液经过 高温加热而超高速喷雾，产生的离子进入MS，中性

5、分子由真空泵抽走。TS只能获得与分子 量有关的信息。在热喷射过程中会使热不稳定化合物分解，在一定程度上被API取代。3. 粒子束（PB）利用溶剂与被分析物的动量差分离（与气相色谱/质谱仪上的玻璃喷嘴分离器原理相 似），进入质谱后用EI或CI方式电离，优点是能提供传统的EI和CI质谱图。4. 连续流动快原子轰击（CFFAB）与静态的快原子轰击（FAB）类似。5. 大气压电离（API）（接口与电离相结合）八十年代后期出现，大气压电离源顾名思义是一种常压电离技术，在大气压下电离， 仅把带电离子“吸入”质谱，不能提供经典的质谱图。目前大气压电离特指：电喷雾(ESI), 离子喷雾(IS)和大气压化学电离

6、(APCI)。由于它不需要真空、减少了许多设备，方便使 用，而且有下面的优点，因而在近年来得到了迅速的发展。(1) .由于产生多电荷离子(在ESI和IS下)，测定分子量可以达到10万道尔顿以上(2) .灵敏度达fg-pg(3) .适用于极性和离子型化合物(4) .进样方式多样灵活a) 直接流动进样b) 与液相色谱联用c) 与毛细管电泳联用三.接口原理1.电喷雾电离(ESI)电喷雾电离是一种“软”电离技术，ESIMS既可分析小分子也可分析大分子。对于分 子量在1000 Dalton (简写为Da,现法定计量单位写为u)以下的小分子，会产生M+H + 或M-H-离子，选择相应的正离子或负离子形式进

7、行检测，就可得到物质的分子量。此外， 也可能源内CID生成一些碎片，有利于提供样品分子的结构信息。而分子量高达20，000 u 的大分子在ESI-MS中常常生成一系列多电荷离子，通过数据处理系统能够得到样品的分子 量，准确度优于土 0. 01 %。(1) .电喷雾机理电喷雾电离是在液滴变成蒸汽产生离子发射的过程中形成的，这种过程也称为“离 子蒸发”，如图2所示。溶剂由泵输送从不锈钢毛细管流出，由于它带35kV高压，与对应 极之间产生的强电场促使溶剂在毛细管出口端发生喷雾，产生带强电荷的液体微粒，所以称 为电喷雾。随着液体微粒中溶剂蒸发，离子向表面移动，表面的离子密度越来越大，最终逸 出表面，蒸

8、发进入空间。所以离子形成的过程实际上是在大气压下发生的。(2) .电喷雾离子源(离子喷雾)Includes lonSpray, TurboIonspray, NanoSpray图3是电喷雾离子源结构的详细示意图。样品溶液经过内径75um、带34kV高压的 不锈钢毛细管进入离子源，毛细管外有一个同轴套管，通入N2气作为雾化气抵达探头端口 的液滴。由于高压和雾化气的作用，使液滴生成含样品与溶剂离子的气溶胶。同时，与喷雾 针成一角度还通入加热干燥的N2气，进一步除去溶剂，并有效防止仪器污染,整个电离和除 溶剂过程都是在常压下进行。2调节锥体电压可使离子源输出的离子数达最佳条件，它通常以M+H+或M-

9、H-是否最佳 来衡量。但是，增加锥体电压会加速离子向锥体分离器移动。由于按质谱标准该区域仍处于 高压。样品离子仍有可能与气体或蒸汽分子碰撞而生成离子碎片。锥体电压增加越大，离子 碎裂也越加剧。这种效应可产生反映样品结构信息的碎片，而且重现性好，还可用碎片离子 准确进行物质的定量分析。由此可产生裂片的功能称为源内CID (碰撞诱导分解)。2 大气压化学电离(Heated Nebulizer或APCI)管的外套管内通入热的N2雾化气至毛细管口流出的液体，加热的探头与N2雾化气的共同作 用使流出液生成气溶胶后蒸发。雾化气管外还有一根同轴套管通N2屏敝气。将蒸发的气溶 胶导入APCI源。大气压化学电离

10、源其余部份与电喷雾源相似，所不同的是帘板前还有一个放电尖端，放电尖端装在一种Peek工程塑料上，其上加34. 5kV电压(负离子检测用2 3. 5kV)。而喷雾毛细管不带电压。它们之间放电的能量使毛细管流出经过离子源的溶剂 分子发生电离。生成的离子还与其它溶剂分子碰撞，每次碰憧均消耗能量生成低能气态等离 子。样品分子通过等离子区域时，由于质子转移或试剂离子作用而电离。因而整个电离都在 常压下由化学溶剂作用而产生，所以称为大气压化学电离。3. 电喷雾与大气压化学电离的比较电喷雾电离与大气压化学电离在结构上有很多相似之处，但也有不同的地方。掌握它们 的差异对正确选择不同电离方式用于不同样品的分子量

11、测定与结构分析具有重要的意义。它 们的主要差别是：电离机理：电喷雾采用离子蒸发方式使样品分子电离，而APCI电离是放电尖端高压放电 促使溶剂和其他反应物电离、碰撞、及电荷转移等方式形成了反应气等离子区，样品分子通 过等离子区时，发生了质子转移而生成M+H+或M-H-离子。样品流速：APCI源允许的流量相对较大，可从0. 2到2 ml/min，直径4. 6 mm的高效 液相色谱(HPLC)柱可与APCI接口直接相连;而电喷雾源允许流量相对较小，最大只能为1.0 ml / min，最低流速可小于5ul / min，通常与HPLC的微径柱如2. lmm或毛细管色谱柱相 连。断裂程度；APCI源的探头

12、处于高温，尽管热能主要用于汽化溶剂与加热N2气，对样品影 响并不大，但对热不稳定的化合物就足以使其分解，产生碎片，而电喷雾源探头处于常温， 所以常生成分子离子峰，不易产生碎片。灵敏度：APCI与ESI源都能分析许多样品，而且灵敏度相似，很难说出哪一种更合适。 同时至今没有一个确切的准则判断何时使用某一种电离方式更好。但是通常认为电喷雾有利 于分析生物大分子及其它分子量大的化合物，而APCI更适合于分析极性较小的化合物。多电荷：APCI源不能生成一系列多电荷离子，所以不适合分析生物大分子。而ESI源特 别适合于蛋白质，多肽类的生物分子，由于它能产生一系列的多电荷离子。4. NanoFlow AP

13、I 接口专门设计的 NanoFlow API接口特别适合于做微量的生化样品，其流速范围可从5nL / min到luL / min。一滴样品就可做数小时的分析。可在最小的样品消耗量下获得最大 灵敏度。灵敏度可高达fmole。并可直接与微孔HPLC联用。5. 液相色谱一质谱各种联用技术的比较表LC/MS各种联用技术的比较技术流速(mUmin)提住信息祥品类殍适用的 MWSS焦喷霁(TP)1-2MHM-H)-极性水溶物如药物. 1 m等离子体喷雾(PSP)0.5-2及碎片极性小于TSP分析的样品1000粒于束(LINC)0.2-1M + ,及碎片El型谱图非极性物质如农药,脂肪酸1000大气压化学电

14、离(APCI)0.2-2及碎片极性物质，如农药，偶氮染 1000 amu(M + nH)n+. CM -极性物质,如肽类M t . _klEC.JU* *1 flM?rtl10,000电质雾(ESI)1 M/min1 ml/minnH)-,分字 1000 amu MH*, (M -H) 及碎片职炎，重曰质，寡孩甘KE； 08 类，药物等。200,0006. LC/MS与LC/UV的比较(图)四. LC/MS对LC的要求1. ESI的最佳流速是150 ul /min,应用4.6 mm内径LC柱时要求柱后分流比Vl / 50, 目前大多采用l2 mm内径的微柱，并配置0. 1100ul/min的微

15、量泵。采用毛细管LC 柱时，柱后必须补充一定的流量。2. APCI的最佳流速lml / min，常规的直径4.6mm柱最合适。3. LC/MS接口避免进入不挥发的缓冲液，避免含磷和氯的缓冲液，含钠和钾的成分必须 Vlmmol/l。含甲酸(或乙酸)2%。含三氯乙酸0.5%。含三乙胺Vl %。含醋酸胺V10 一 5 mmol/l0 LC色谱柱生产商提供了大量的文献帮助色谱工作人员选择流动相，但是这些 资料并不包括最佳的LC分离。当用API作为接口使LC与MS联用时，磷酸盐缓冲液不适合 LC-MS系统。送样前一定要摸好LC条件，能够基本分离，缓冲体系符合MS要求。4. 总离子流(TIC)可以与UV图相对照，基峰离子流(PBI)有时将更清晰地反映分离 状况，特征离子的质量色谱在复杂混合物分析及痕量分析时是LC/MS测定中最有用的谱 图，它既有保留值信息，又具备化合物结构的特征，抗化学干扰性能好，常用于定性定量。 因此，为了提高分析效率，常采用V 100 mm的短柱(此时UV图上并不能获