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1、文件题目薄层扫描法检验操作规程编码：ZL-S0P(TY)-1002-00共5页第1页制定人日期审核人日期QA审阅日期批准人日期颁发部门质量管理部回新订 修订生效日期分发部门质量管理部、技术部目 的：建立薄层扫描法的标准操作规程范 围：本规程适用于薄层扫描法。职 责：检验员、 QC 主任。依 据：中国药典 2010 年版。内 容：1 简述薄层色谱扫描法是指用一束一定波长、一定强度的紫外或可见光对薄层板进行扫描， 测定薄层板上的样品斑点对光的吸收强度或斑点经激发后所产生的荧光强度。所得到的图 谱及积分数据可用于药品的鉴别、检查及含量测定。薄层色谱扫描法可分为吸收法与荧光法。扫描时测定薄层板上的样品
2、斑点对光的吸收 强度的方法称为吸收法；测定样品斑点经激发后所产生的荧光强度的方法称为荧光法。吸 收法测定可采用反射法或透射法两种方式进行扫描。反射法是指测定样品斑点对照射光的 反射情况进行测定的方法；透射法则是测定照射光穿透样品斑点后光的吸收情况。荧光法 测定均采用反射法。透射法大多用于凝胶色谱的扫描，非透明介质薄层板的扫描主要为反 射式吸收法或荧光扫描法。薄层色谱扫描可使用单波长和双波长进行测定。单波长薄层扫描适合于分离度好，背 景干扰小的薄层色谱。双波长薄层扫描时用测定波长和参比波长分别扫描薄层板，测定样 品斑点在两波长下的吸收度之差，可减少分离度欠佳的组分间的相互干扰，并减少薄层板 的背
3、景干扰，操作时应选择待测斑点无吸收或最小吸收的波长作为参比波长。根据扫描时光束的轨迹不同，薄层色谱扫描又可分为线性扫描和锯齿扫描。线性扫描 时一般采用一束比待测斑点略宽的狭窄光带沿展开方向做单向等速扫描，它适于形状较规 则斑点的扫描。锯齿扫描是使用微小正方形光束沿展开方向扫描的同时，在垂直于展开方 向进行往复式扫描，扫描过程中光束的运动轨迹呈锯齿形或矩形，它对于形状不规则或分文件题目薄层扫描法检验操作规程编码：ZL-S0P(TY)-1002-00共5页第2页布不均匀的斑点扫描重复性较好，但扫描速度较慢。在采用反射式吸收法测定时，入射光照射到薄层板上，一部分光透射过薄层板，一部分光发生反射，此外
4、还产生大量的散射光。因此，薄层扫描定量一般不符合Lamber t-Beer 定律，其样品量与反射光强度符合Kubelka-Munk方程：（l-R）2/R=2.303 C/S其中R为反射光强，为样品吸收系数，C为样品浓度，S为薄层板散射系数。由此方程可知，样品吸收系数和薄层板散射系数均可影响薄层扫描反射法定量的工作 曲线方程。2 仪器2.1 仪器组成 薄层扫描仪主要由光源、单色器、薄层板台、检测器以及工作站组成。2.1.1光源在可见光区域主要使用钨灯（370700nm），紫外区多使用氘灯（200 370nm）。此外还有汞灯，氙灯等。其中汞灯为线光源，可发射特征辐射光谱。2.1.2 单色器用来提供
5、一定波长的单色光。其结构与一般的紫外分光光度计类似，通 常由入射狭缝、出射狭缝、平行光装置、色散元件等组成。薄层扫描仪多采用光栅为其色 散元件。2.1.3 薄层板台 扫描时薄层板固定于薄层板台上，薄层板台可横向及纵向移动，以 完成对整块薄层板的扫描。2.1.4 检测器 多采用光电倍增管。此外还有监测入射光能量的参比光电倍增管，以 减少入射光强度变化对扫描结果的影响。2.1.5 工作站 可设定仪器参数，接收并存储扫描结果，进行积分和其他计算。2.2 仪器性能检定2.2.1 波长准确度的检查可利用汞灯的特征谱线光谱对仪器的波长准确度进行检查。选取汞灯，在200700nm波长范围内以荧光方式对空白硅
6、胶.薄层板扫描吸收图谱，图谱 中的峰位波长与汞灯的谱线中相应波长的差即为仪器波长准确度。汞灯谱线的已知波长为 253.6,313.0,334.2,365.0,404.7,435.8,546.1,578.0nm。在 CAMAG 等仪器的工作站中有专 用的仪器检定软件，按要求操作即可自动进行仪器波长准确度等检查。其结果应符合仪器文件题目薄层扫描法检验操作规程编码：ZL-S0P(TY)-1002-00共5页第3页相应的有关规定。日常工作中波长准确度的初步核对可采用以下方法：于硅胶G薄层板上点样10卩l浓度 约为10mg/ml的磷酸氯喹水溶液，用氘灯以反射方式对样品斑点作光谱扫描（200360nm）,
7、 扫描所得的谱图应在（25710）nm和（34310）nm处有最大吸收峰。2.2.2 重复性测定对薄层板上同一斑点重复多次扫描，计算结果的标准偏差。取脱水穿心莲内酯对照品适量，加无水乙醇制成每ml含lmg的溶液。取1p l点于硅胶GF薄层板上，以三氯甲烷-乙254酸乙酯-甲醇（4: 3:0.4）为展开剂，展开，取出，晾干。按双波长薄层色谱扫描法，连续扫描10次，扫描波长：入=263nm,入=370nm，以峰面积积分值计算相对标准偏差，锯齿SR扫描应三1.5%，线性扫描应三2.0%。3 操作方法3.1 样品前处理 应按各品种项下规定，制备供试品和对照品溶液。如进行薄层色 谱扫描定量，则取样不少于
8、2份，平行操作。3.2 薄层色谱操作 应照薄层色谱法标准操作规范操作，保证薄层色谱质量。3.3 样品测定测定时应按各品种项下的具体规定，依据不同仪器的结构特点及使用说明，正确选择 仪器参数进行扫描。3.4 系统适用性试验 按各品种项下要求进行，包括检测灵敏度（用于限量检查）、分离度和重复性，应符合规定。3.4.1 检测灵敏度 系指用于限量检查时，被测成分能被检出的最低量。一般采用对 照品溶液与稀释若干倍的对照品溶液在规定的色谱条件下，于同一薄层板上点样、展开、 检视，后者显清晰的斑点的点样量为检测灵敏度。3.4.2 分离度 用于鉴别时，对照品溶液与供试品溶液色谱中相应的主斑点，均应显 示两个清
9、晰分离的斑点。用于限量检查或含量测定时，要求定量峰与相邻峰之间有较好的 分离度，分离度（R）的计算公式为：R=2（d-d）/（W+W）2 1 1 2式中 d 为相邻两峰中后一峰与原点的距离；2文件题目薄层扫描法检验操作规程编码：ZL-S0P(TY)-1002-00共5页第4页d 为相邻两峰中前一峰与原点的距离；1W 及 W 为相邻两峰各自的峰宽。12除另有规定外，分离度应大于1.0。3.4.3 重复性 系指同一薄层板上同一供试品溶液相同浓度的数个斑点，扫描结果的 偏差。如薄层板展开后直接扫描，同一薄层板上平行点样的待测成分斑点(不少于4个点) 的峰面积测量值的相对标准偏差应不大于3.0%；如需
10、显色后扫描，其相对标准偏差应不大 于5.0%。3.5 薄层色谱扫描含量测定反射式吸收法测定时，样品量与反射光强度不呈直线的线性关系。但是在一个较窄的 范围内，曲线可近似为一条直线，从而采用外标一点法或两点法定量测定。如在测定范围 内工作曲线直线回归线性关系较差，可根据不同仪器采用不同方法进行校正。在岛津CS系 列薄层扫描仪上，有线性补偿器(Linarizer)，它可依据Kubelka-Munk方程用电路系统 将弯曲的曲线校正为直线后用于定量。在实验时应根据薄层板及样品性质正确选择SX值， 防止校正不足或校正太过，影响薄层扫描定量结果。CAMAG等薄层扫描仪则可使用二次方 程曲线表达样品量与反射
11、光强度之间的关系，在分析时采用多个浓度对照品测定值回归计 算出二次方程工作曲线，再根据此工作曲线计算样品含量。含量测定时供试品溶液和对照品溶液应交叉点于同一薄层板上，每份供试品溶液点样 不得少于2个，对照品每一浓度不得少于2个。其计算结果的相对平均标准偏差应不大于5%。4 注意事项4.1 除另有规定外，薄层色谱扫描法含量测定应使用市售薄层板。4.2 薄层色谱分析的各个步骤如点样、展开等，均会影响薄层扫描结果的准确性与 重现性，因此在实验的各个步骤均应规范操作。4.3 扫描时应沿展开方向自下而上进行扫描，不可横向扫描。4.4 测定记录中应包括薄层色谱扫描图，峰面积积分值，工作曲线、回归方程和相 关系数，以及测定结果计算等。4.5 根据实际情况，可调整供试品溶液及对照品溶液的点样量，以便测定。4.6 为保证测定结果的准确性，采用外标一点法测定时，供试品斑点应与对照品斑点文件题目薄层扫描法检验操作规程编码：ZL-S0P(TY)-1002-00共5页第5页的峰面积的值相近；采用外标两点法测定时，供试品斑点的峰面积应在两对照品斑点的峰面积值之间。
