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1、黄芪丹参茯苓龟板合剂对大鼠肾间质纤维化的抑制作用江贤萍;韩新华;张秀辉【摘 要】目的 探讨黄芪丹参茯苓龟板合剂对肾间质纤维化进展过程的干预作用及 其机制.方法 通过单侧输尿管梗阻法建立肾间质纤维化的大鼠模型,实验分为假手术 (Sham)组、单侧输尿管梗阻(UUO)组、血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)组及黄 芪丹参茯苓龟板合剂(中药)组,术后第14天取大鼠肾组织进行常规HE、Masson 染色及CD68、a-SMA的免疫组化检测结果ACEI组及中药组肾间质纤维化程 度、CD68和a-SMA的表达均低于UUO组(Pv0.05);(2)中药组肾间质纤维化程 度、CD68和a-SMA的表达低于ACE
2、I组(Pv0.05).结论黄芪丹参茯苓龟板合剂具 有抑制肾间质纤维化的作用,其机制可能是抑制间质单核巨噬细胞的浸润,并阻止间 质细胞发生转分化.Objective To investigate the interventional effect of Chinese herbs on renal tubulointerstitial fibrosis after unilateral urethral obstruction ( UUO ) in rats. Methods The experimental rats were randomly divided into four groups
3、: sham-operated group for control ( Sham group ), unilateral ureteral obstruction group ( UUO group ), angiotensin converting enzyme inhibitor treatment group ( ACEI group ) and Chinese herbs group. The kidney tissues were collected from each group on 14d after operation. Hematoxylin-eosin stain and
4、 Masson stain were used to measure tubulointerstitial fibrosis and immunohistochemical method was performed to detect CD68 and ol-smooth muscle actin. Results ( 1 )The degree of renal tubulointerstitial fibrosis, and the expression of CD68, aSMA were reduced in ACEI group and Chinese herbs group com
5、pared with UUO group( P v0. 05 ). ( 2 )The degree of renal tubulointerstitialgroup compared with ACEI group( P 0.05 ). Conclusion Chinese herbs canprevent the renal interstitial fibrosis after unilateral urethral obstruction in rats, through inhibiting the infiltration of mononuclear macro-phage in
6、mesenchymal anc transcifferentiation of interstitial cells.【期刊名称】安徽医药【年(卷),期】2012(016)006【总页数】3页(P743-745)【关键词】肾间质纤维化中药；CD68;a-SMA【作者】江贤萍;韩新华;张秀辉【作者单位】广东省深圳市儿童医院病理科,广东,深圳,518026;广东省深圳市南山 区蛇口人民医院内科,广东,深圳,518037;四川大学华西医院病理科,四川,成 都,610041【正文语种】中文肾间质纤维化是各种肾脏疾病发展到慢性肾衰竭的共同结局，在其进展过程中，表 现为单核巨噬细胞等炎细胞浸润，转分化而来
7、的肌纤维母细胞向间质游走并分泌大 量胶原纤维等基质成分1，2。因此，控制肾间质巨噬细胞浸润、抑制间质细 胞发生转分化是治疗肾间质纤维化的重要途径之一3。抗间质纤维化的中药研 究多限于对单味中药或其提取物的研究，对中药复方的研究则较少。本研究以国际 公认较为成熟的抗间质损害药物血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI作阳性对照，观察黄芪丹参茯苓龟板中药合剂在整体环境中对肾间质纤维化进展过程的干预作用， 探索新的肾间质疾病治疗途径。1 材料和方法1.1 动物模型的建立、分组及标本收集1.1.1动物模型的建立以速眠新口行腹腔注射(0.75 mlkg-1)麻醉大鼠后，将大鼠 右侧卧位固定于手术台，背部左肋下备
8、皮，消毒、铺洞巾，沿腋后线从左肋下向尾 部方向0.5 cm处作切口，暴露左肾，寻找并游离输尿管，距肾门约57 mm处 用4.0丝线上下结扎两处，从中剪断输尿管，最后逐层缝合皮下组织及皮肤。1.1.2实验分组及标本处理60只雄性Wistar大鼠购自四川大学实验动物中心(动 物许可证号:scxk(川)-10-2006),7周龄，体重(20020)g。大鼠于清洁级标准动 物房喂养1周后，随机分为四组:假手术(Sham)组、单侧输尿管梗阻(UUO)组、 ACEI组及中药组，每组各15只。Sham组大鼠除不结扎离断输尿管外，余步骤 同上。造模前24 h开始给药，ACEI组给予ACEI 8 mgkg-1d
9、-1灌胃，中药组给 予黄芪丹参茯苓龟板合剂24 gkg-1d-1灌胃，UUO组、Sham组同时以等量的 生理盐水灌胃，灌药至术后第13天。 各组大鼠术后第14天处死取梗阻侧肾脏，经4%中性甲醛固定，石蜡包埋。1.2主要试剂及药品蒙诺(ACEI)购于中美上海施贵宝公司，批号:60706;速眠新口 购于长春军需大学兽医研究所，批号:吉牧防便字199047号;黄芪丹参茯苓龟 板中药合剂液由四川大学华西医院煎药房配制(黄芪：丹参：茯苓：龟板 =2：1：1：1,浓度:3 gml-1)。兔抗大鼠a-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)多克隆抗体 购于武汉博士德试剂公司，鼠抗大鼠巨噬细胞CD68单克隆抗体购至福州迈
10、新公 司。1.3 检测指标1.3.1常规及Masson染色常规苏木素-伊红(HE)染色，观察肾组织病理学改变。Masson染色:每张切片随机选取10个不重叠高倍镜视野(x400), HPIAS-1000彩色病理图文分析系统对所选视野内绿染信号计算机读片，以绿染的胶原面积占整 个视野面积的百分比平均值作为肾间质纤维化的半定量分析测定值。1.3.2免疫组化采用S-P法,a-SMA和CD68工作稀释度均为1:100a-SMA 以正常血管组织为阳性对照，CD68以脾组织为阳性对照，以PBS代替一抗作空 白对照。高倍镜下(x400)随机选取10个不重叠的视野，计数每个视野中CD68阳性细胞数 及a-SM
11、A阳性细胞数，取其平均值进行统计分析。1.4统计学分析应用SPSS13.0软件进行统计学分析。所有数据以均数士标准差表 示，多个样本均数间比较采用单因素方差分析，采用SNK检验比较各组间差异。 以Pv 0.05表示差异有统计学意义。2 结果2.1肾脏病理学变化术后14 d,除Sham组外，各手术组均出现梗阻性尿潴留，梗阻侧肾脏明显膨大，实质变薄或呈囊状，重量增加。镜下观察，大鼠梗阻侧肾组 织间质中可见单核巨噬及淋巴细胞浸润，细胞外基质增多，肾小管不同程度扩张， 部分肾小管管腔内有蛋白和细胞管型，肾小管上皮细胞空泡变性，可见坏死，病变 以UUO组最重，两治疗组病变程度较轻。2.2 Masson染
12、色Sham组绿染区主要位于肾小管基底膜、系膜区，小管间质染色 较少。UUO组及两治疗组的肾小管间质绿染面积增大，以UUO组最大，组间比 较差异有统计学意义(F=195.54 , Pv0.001);两两比较显示，中药组间质面积比值 低于 ACEI 组(Pv0.05)(表 1)。2.3 免疫组化2.3.1 CD68的表达Sham组偶见巨噬细胞，UUO组肾间质CD68阳性细胞呈弥 漫性浸润，两治疗组大鼠肾间质CD68阳性细胞数均较UUO组减少(F=77.53 , P V 0.01)(图1 3);两两比较显示，中药组较ACEI组减少更为明显，差异有统计学 意义(PvO.O5)(表 1)。图1 UUO组
13、肾间质见较多CD68阳性细胞(IHC S-P法x400)图2 ACEI组肾间质见少量CD68阳性细胞(IHC S-P法x400) 图3中药组肾间质见个别CD68阳性细胞(IHC S-P法x400)2.3.2 a-SMA的表达Sham组肾脏a-SMA仅表达于血管平滑肌细胞，在肾小管 间质几乎无表达。UUO组a-SMA表达明显增加，主要位于内髓部，两治疗组肾 间质a-SMA的表达较UUO组明显减少(F=407.68 , P v 0.001)(图4 6);两治疗 组比较，中药组a-SMA的表达减少更明显(P v 0.05)(表1)。图4 UUO组小管周围大量a-SMA阳性细胞(IHCS-P法x400
14、)图5 ACEI组小管周围a-SMA阳性细胞减少(IHCS-P法x400) 图6中药组小管周围a-SMA阳性细胞明显减少(IHCS-P法x400)3 讨论正常肾组织a-SMA的表达仅见于肾脏血管，而肾小球和肾间质中无或极少表达， 说明正常肾脏几乎无肌纤维母细胞。研究表明，肌纤维母细胞可能由肾脏固有成纤 维细胞、小管上皮细胞、血管壁平滑肌细胞发生转分化而来，并表达a-SMA。转 化形成的肌纤维母细胞形态学发生变化，增殖活跃，可向间质处游走，合成和分泌 大量胶原纤维等基质成分，同时能分泌成纤维细胞生长因子(FGF-1)、血小板衍生 生长因子(PDGF)、转化生长因子PKTGF-P1)、细胞间黏附分
15、子(ICAM-1)及肿瘤 坏死因子a(TNF-a)等一系列细胞因子和趋化因子，促进肾间质纤维化的形成4 , 5。肾间质纤维化发展过程中单核巨噬细胞浸润也发挥着重要的作用，活化的单 核/巨噬细胞是多种促间质纤维化因子的重要来源。有研究提示肾间质单核巨噬细 胞积聚的程度与相应部位的纤维化程度呈正相关，抑制肾间质单核巨噬细胞浸润， 可能是治疗肾间质纤维化的重要途径之一3。中医虽无纤维化的名称，但从纤维化形成的病理基础来看，与血瘀证密切相关，属 于肾络瘀阻。一般认为慢性肾间质纤维化病变是因脾肾虚亏、气机逆乱、脉络瘀阻， 导致肾组织硬化缩小及肾功能的衰退6。邓英辉等7的研究发现黄芪注射 液对大鼠肾间质纤
16、维化具有明显的改善作用，这种作用部分通过是抑制TGF-P1表 达，阻止肾小管上皮细胞转分化及减少胶原合成实现的。丹参是中医用于活血化瘀 的药物，丹参中的有效成分丹参总酚酸可降低大鼠肾间质TGF-P1的表达，从而抑 制肾间质纤维化的形成8。茯苓及龟板主要见于肝纤维化的研究，尚未见对肾 间质纤维化影响的研究。茯苓通过下调TGF-P1及PDGF表达，促进细胞外基质 降解，抑制肝纤维化的发展9,鳖甲提取物则通过降低IV型胶原和皿型胶原的 含量而发挥抗肝纤维化的作用10。本研究证实黄芪丹参茯苓龟板中药合剂可 以通过抑制单核巨噬细胞浸润及肌纤维母细胞的形成，阻止肾间质纤维化的发展， 且疗效优于ACEI类药物，由此提示黄芪丹参茯苓龟板合剂作为肾脏疾病治疗的新 思路，值得进一步深入研究、探讨和评估。表1肾间质胶原面积比值、CD68及a-SMA阳性细胞数仕s）注:与U
