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1、AFLP 技术的基本原理与实验方法AFLP 技术的基本原理:AFLP 技术是一项新的分子标记技术，其原理是：基因组DNA经过二种酶不同的限制性内切酶酶切后，产生粘性末端，再使用连接酶将人工合成的双链接头连接在酶切位点的粘性末端。接头一端具有与内切酶同样的识别粘性末端，互补连接后成为DNA模板进行预扩增。接头和与接头相邻的酶切片断的几个碱基序列作为引物的结合位点。引物由3部分组成: 核心碱基序列，该碱基序列与人工接头互补；特异性酶切序列；引物3端选择性碱基。选择性碱基延伸到酶切片段区，这样就只有那些两端序列能与选择碱基配对的限制性酶切片段被扩增。另外，通过选择在末端分别添加了13个选择性核苷酸的
2、不同引物，可以达到选择扩增的目的。这些选择性核苷酸使得引物选择性地识别具有特异配对序列的内切酶酶切片段。并与之结合，实现特异性扩增。实验方法:(1) DNA 酶切AFLP技术成功的关键在于DNA的充分酶切,所以对模板质量要求较高,在DNA完全溶解后利用紫外分光光度仪测定DNA浓度，将DNA浓度用双蒸水调整到50ng/ul,应避免其他DNA污染和抑制物质的存在。表1：E-M酶切体系反应体系（E-M组合）1/2倍1倍DNA（50ng/ul）1.50ul3.0 ulEcoR(10u/ ul)0.25ul0.5 ulMse (10u/ ul)0.15ul0.3 ulTango Buffer (10)2
3、.50ul5.0 ulddH2O8.10ul16.2 ul总体积12.5ul25 ul表2：P-M酶切体系反应体系（P-M组合）1/2倍1倍DNA（50ng/ul）1.50ul3.0 ulPst(10u/ ul)0.25ul0.5 ulMse (10u/ ul)0.15ul0.3 ulBuffer R (10)1.25ul2.5 ulddH2O9.35ul18.7 ul总体积12.5ul25 ul表3：P-T酶切体系反应体系（P-T组合）1/2倍1倍DNA（50ng/ul）1.50ul3.0 ulTaq(10u/ ul)0.15ul0.3 ulPst (10u/ ul)0.5ul1.0 ulB
4、uffer Taq (10)1.25ul2.5 ulddH2O9.10ul18.2 ul总体积12.5ul25 ul表4：E-T酶切体系反应体系（E-T组合）1/2倍1倍DNA（50ng/ul）1.50ul3.0 ulTaq(10u/ ul)0.3ul0.6 ulEcoR(10u/ ul)0.25ul0.5 ulBuffer Taq (10)1.25ul2.5 ulddH2O9.20ul18.4 ul总体积12.5ul25 ul表5：M-S酶切体系反应体系（M-S组合）1/2倍1倍DNA（50ng/ul）1.50ul3.0 ulSac(10u/ ul)0.5ul1.0 ulMse (10u/
5、ul)0.3ul0.6 ulTango Buffer (10)1.25ul2.5 ulddH2O8.95ul19.9 ul总体积12.5ul25 ul表6：T-S酶切体系反应体系（T-S组合）1/2倍1倍DNA（50ng/ul）1.50ul3.0 ulSac(10u/ ul)0.25ul0.5 ulTaq(10u/ ul)0.3ul0.6 ulBuffer Sac(10)1.25ul2.5 ulddH2O9.2ul18.4 ul总体积12.5ul25 ul表7：常用内切酶酶切位点、最适温度、接头名称和预扩引物内切酶酶切位点最适反应温度接头名称预扩引物选扩引物EcoRGAATTCCTTAAG37
6、EadEAECEA01EA16EC01EC16MseTTA AAATT65MadMCMGMC01-MC16MG01-MG16PstCTGCAGGACGTC37PadP0P001- P016TaqTCGAAGCT65TadTCTGTC01-TC16TG01-TG16SacGAGCTCCTCGAG37SadSASA01-SA16先将模板吸入PCR板中，再将内切酶、Buffer、双蒸水配制为Mix（因内切酶用量很少或者因少数枪头质量问题，每次吸取内切酶时一定要注意观察吸取是否足量），将配制好的Mix加入到模板中，最后在配好的反应体系中加入矿物油覆盖离心，放入PCR仪或水浴锅中37条件下56小时，然后
7、立即转入65条件下1小时完全酶切。一般做1/2倍体系即可。目前本实验室拥有的内切酶有：EcoR；Mse；Pst；Taq；Sac,以上内切酶均为Fermentas公司生产。(2) 连接表8：连接体系连接体系1/2倍1倍接头Ead/Pad/Sad0.5 ul1.0 ulMad/Tad0.5 ul1.0 ulT4连接酶（10u/ ul)0.15 ul0.3 ulT4连接酶Buffer2.5 ul5 ulddH2O8.8 ul17.7 ul总体积12.5 ul25 ul在连接的过程中不同的内切酶都有其对应的接头（表7），不同的酶切组合就用相应的接头组合。将配制好的连接Mix加入酶切产物中（要与酶切体系
8、等体积），用保鲜膜包好室温下连接过夜。在配制连接Mix时T4连接酶Buffer容易产生沉淀，最好待其完全融解后适当振荡将沉淀溶解。接头的制备：在公司合成的接头为单链干粉（2 oD/管，要将接头制备为双链。Mad的制备程序是，先将MF和MR干粉在12000/分钟离心一分钟，然后MF加入127ul，MR加入135ul双蒸水完全溶解后各取127ul混合，在65水浴锅中10min再转入37/10min最后室温下放置10min即可。Ead、 Pad、Sad和Tad的制备程序是，先将EF(PF、SF、TF)和ER(PR、SR、TR)干粉在12000/分钟离心一分钟，然后EF(PF、SF、TF)加入1270
9、ul，ER(PR、SR、TR)加入1350ul双蒸水完全溶解后各取350ul混合，在水65浴锅中10min再转入37/10min最后室温下放置10min即可。（3）预扩增：将连接产物稀释5倍混匀后作为预扩增的模板，在预扩的过程中每一种内切酶都有其对应的一组或两组预扩引物（表7），不同的酶切组合就用对应的一组或多组预扩引物组合。表9：预扩体系（以E-M组合为例）预扩体系1倍2倍DNA（连接产物稀释）5 ul10 ulBuffer2.5 ul5.0 ulMgCl22.0 ul4.0 uldNTP0.4 ul0.8 ulTaq0.2 ul0.4 ulddH2O13 ul26 ulPrimer1 EA
10、EC1.0 ul2.0 ulPrimer2 MCMG1.0 ul2.0 ul总体积25 ul50 ulE-M组合因为E组合有预扩引物EA和EC，M组合有预扩引物MC和MG，所以E-M组合一共可以进行四种引物组合的预扩增，即EA-MC、EA-MG、EC-MC、EC-MG，其它酶切连接组合可依此类推。将预扩产物在琼脂糖电泳检测，带型应为弥散状。根据检测结果来确定预扩产物稀释倍数，一般为15到30倍。（4）选择性扩增：根据预扩产物琼脂糖电泳检测的结果，将预扩产物稀释适当的倍数混匀后作为选择性扩增的模板表10：选扩体系选扩体系1倍2倍DNA（预扩产物稀释）3 ul3 ulBuffer1.5 ul3.0
11、 ulMgCl21.2 ul2.4 uldNTP0.3 ul0.6 ulTaq0.2 ul0.4 ulddH2O6.8 ul13.6 ulPrimer1 EA01EA16EC01EC161.0 ul2.0 ulPrimer2 MC01MC16MG01MG161.0 ul2.0 ul总体积15 ul30 ul每一种预扩引物组合扩增的产物可以有1616256对对应的其选扩引物进行选择性扩增。例：如果预扩引物组合为EA-MC，那么EA对应的就会有EA01到EA16共16对选扩引物，MC对应的就有MC01到MC16共16对选扩引物，而它们进行随机组合就可以形成1616256对选扩引物组合了。最后将选择
12、性扩增产物变性后在聚丙烯酰胺变性凝胶上电泳检测。由于AFLP实验步骤繁琐，涉及实验试剂多，极易造成实验体系不稳定导致实验失败，所以酶切、连接、预扩和选扩实验应在冰上操作完成，并严格按照操作规范操作。实验中所用到的酶、接头和引物要防止污染和降解。实验如果失败应首先从酶切开始分步设置对照找到失败原因，以免造成不必要的浪费。PCR反应程序预扩程序：1.9512.95303.56304.7215.Go to 2, 19 times6.1030选扩程序：1.94302.6530-0.7 per cycle3. 7214. Go to 1, 12 times5.94306.56307.7218.Go to 5, 24 times9.1030
