柱压问题文档

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1、色谱柱在HPLC中是非常关键的部件.一台色谱仪如果没有色谱柱几乎什么工作也做不了。色谱柱是消耗品,有一定寿命，使用中也非常容易出问题。普通的正相反相色谱柱使用得当可用一、两年。使用不得当用两、三个月就可能损坏。所以使用中应该非常注意。1.在使用一根新的色谱柱之前，一定要看柱说明书，将柱子的使用压力、pH值、温度范围和所用流动相种类都要弄清楚。接触最多的是C18色谱柱，它对试剂应用的范围非常广,甲醇、水、乙腈、四氢呋喃、三氯甲烷、正乙烷、各种缓冲盐都适用。但其他的色谱柱所使用的试剂就有一定的要求，有的色谱柱只能使用水，不能使用有机试剂,有的色谱柱只能使用有机试剂，而且使用指定是某一种，象GPC色

2、谱柱。这些事情一定搞清楚，如果流动相使用不对，柱子很快会损坏.另外在更换柱子时不能让不能使用的流动相进入柱子。2。柱子是有方向的，柱子上箭头的方向就是流动相流动的方向。当换新柱子时，不要马上就接到检测器上使用。将柱子入口处接在进样器的出口，柱子出口处(即箭头的一端）先不接检测器，按箭头方向垂直朝上，用流动相（甲醇）以1ml/min的流速冲洗1min左右.将柱子里的小气泡全部赶走以后再接到检测器上，否则小气泡跑到检测池里，就很难赶走，检测器产生噪声信号,基线也就走不好。3.关于压力对色谱柱的影响：常用的正反两相色谱柱一般耐压在1220MPa之间，生产厂家不同,耐压也不同，从理论上讲耐压高的色谱柱

3、柱效就高，但柱效高低不仅与耐压的高低有关，还有其他因素。从使用中看，在保证柱效的同时,耐压不要太高，仪器所显示的压力是流路、混合器、自动进样器、柱压、流通池总体的压力，检查柱压力应分段检查。压力过高不仅柱子受不了,其他的部件也会出问题，例如自动进样器。4.色谱柱对pH值是有一定的使用范围.以硅胶为担体的柱子一般使用范围在27pH。耐碱性能不太好，流动相的pH大于8会使硅胶溶解。有些分析条件须用碱性流动相，这时一定要选耐碱性好的色谱柱，流动相的PH值过高或过低,流动相使用纯水,使用高浓度磷酸盐缓冲溶液，使用离子对试剂等,均可能造成色谱柱填料被化学破坏,这种对色谱柱固定相及键合相的破坏通常是不可修

4、复的.5。色谱柱的使用温度不要超过说明书上规定的温度。一般使用温度在60以下,典型硅胶基质色谱柱的使用温度在5与60之间，高温使用会缩短柱寿命。6。色谱柱使用过程中压力的骤然波动，温度的骤然变化或机械撞击都会对色谱柱床产生影响。进样过程中，进样阀转动太慢引起压力波动；流速的突然增大都应在日常分析中尽量避免.一般说来，在低柱压下操作可大大减少由压力波动造成的柱效损失。这种问题是不可修复的7.色谱柱内存在缓冲盐时，如果用高浓度甲醇或其他有机溶剂冲洗色谱柱，会导致柱内缓冲盐结晶析出，造成柱压明显升高。出现该问题时，反相色谱柱首先应使用20%左右有机溶剂的水溶液低流速冲洗色谱柱，使柱内的盐全部溶解冲出

5、，再换成高浓度甲醇或其他有机溶剂的流动相.8.样品的预处理，许多样品，特别是生物样品与中药材，其组分复杂，样品预处理是影响色谱柱寿命的关键.样品经过常规的前处理后，进样前还需进行以下步骤：a.用微孔过滤膜出除去样品中的不溶颗粒，以免赌塞柱头筛板及柱内填充床，使柱压升高.b。将样品用流动相溶解或用与流动相互溶的溶剂溶解。9.为了保护色谱柱,在色谱柱前接了一个保护柱。保护柱通常是比较短的分析柱,通过吸附可能污染分析柱的强保留杂质,达到保护色谱柱的目的。保护柱的筛板与在线过滤器一样可以阻挡微粒杂质.为了达到最好的保护效果同时避免导致色谱结果的改变，最好选用与分析柱相同或相似的填料填充保护柱。10。色

6、谱柱用合适的溶剂保存,若为C18柱推荐用甲醇保存。在日常分析中，流动相含有的不纯物质和样品中的某些组分会吸附在色谱柱中，随着分析时间的延长，吸附量会越多，所以柱子要经常清洗，一般柱子使用一两个星期洗一次，柱子不同清洗的流动相就不同，C18柱子常用甲醇清洗,不要用水清洗这对柱子不好,一般清洗34小时，另外色谱柱长时间不用，存放时要将柱子洗干净,脏柱子放置时间越长，柱效会大大降低。存放时，柱内应充满溶剂（甲醇或乙腈),两端封死。影响柱压的因素一般有这样几种：1、 流动相的配比（如甲醇水体系在50:50附近柱压是最大的);2、 流速的影响，流速越大柱压越高;3、 使用的溶剂，特别是水一般不应该超过一

7、周（最好23天就换一次),水很容易生细菌从而堵掉系统的（不知道楼主用的是什么水，最好用二次蒸馏水或娃哈哈也行）；4、 整个色谱系统有三重防堵措施，一是溶剂瓶中的砂心过滤，二是两种溶剂混合后有个过滤器，三是进柱子之前有个保护柱（不知楼主的色谱装了保护柱没有，很重要的，否则柱子寿命会缩短很多，有些柱子有保护柱可用400h还没问题，而没保护柱使用不到100h就不行了，当然，保护柱有好几种功能的）,前两个地方一般因为溶剂不纯（包括前面讲的水生细菌）而堵，而保护柱前则会因为前面的原因与所分析的样品性质共同影响而堵，所以每次分析完后一定要先用水冲洗，再用甲醇冲洗（一般各为20分钟左右，冲到柱压不变,像分析

8、专业的一般都会冲洗过夜），一定要冲洗干净，否则用一次下次就会堵了!近几年化验室用的液相色谱仪是越来越多，所用色谱柱的种类也越来越多,问题出的也较多，值得注意的是，不论怎样对色谱柱进行处理，一般都很难恢复到原有水平,因此，大家再使用色谱柱之前一定要看说明书,把以上几项问题搞清楚后再使用,尽量避免发生如上问题.色谱柱在使用中最常见的问题就是柱压升高，如果柱压是在长时间使用过程中缓慢增加，属于正常现象.但柱压在使用过程中突然升高(系统管路堵塞及压力传感器故障除外）,可能的原因有如下几点:（1）、色谱柱头的过滤筛板堵塞或污染;(2）、色谱柱头的填料被样品污染；（3)、色谱柱内缓冲液中的盐遇到高浓度的甲

9、醇或其他有机溶剂，形成结晶析出;（4）、流动相PH值过大或过小使固定相结构破坏或溶解。解决办法如下：（1）、如确定是色谱柱头的过滤筛板被污染,可以将色谱柱反方向用甲醇冲洗至正常压力,或者卸下色谱柱头，将其放在10的稀硝酸内超声清洗10分钟，后再用纯水超声10分钟，重新装入色谱柱。（2）、如确定色谱柱头的填料被污染，将柱头螺丝卸下，挖出柱内前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入，仔细修复后，重新安装上柱头螺丝。(3）、如确定定是盐结晶，用10的甲醇/水冲洗色谱柱使柱内盐全部溶解,再换高浓度甲醇.（4）、如果因PH值使用不当，很难恢复。 色谱柱在使用中最常见的问题就是柱压升高，如果柱压是在长时间

10、使用过程中缓慢增加,属于正常现象。但柱压在使用过程中突然升高(系统管路堵塞及压力传感器故障除外），可能的原因有如下几点：（1）、色谱柱头的过滤筛板堵塞或污染；（2）、色谱柱头的填料被样品污染;（3）、色谱柱内缓冲液中的盐遇到高浓度的甲醇或其他有机溶剂，形成结晶析出；（4)、流动相PH值过大或过小使固定相结构破坏或溶解。解决办法如下:（1）、如确定是色谱柱头的过滤筛板被污染，可以将色谱柱反方向用甲醇冲洗至正常压力,或者卸下色谱柱头，将其放在10%的稀硝酸内超声清洗10分钟，后再用纯水超声10分钟，重新装入色谱柱。(2)、如确定色谱柱头的填料被污染，将柱头螺丝卸下,挖出柱内前段被污染的填料,用相同

11、的柱填料重新填入，仔细修复后,重新安装上柱头螺丝。（3)、如确定定是盐结晶，用10%的甲醇/水冲洗色谱柱使柱内盐全部溶解，再换高浓度甲醇。（4）、如果因PH值使用不当，很难恢复. 高效液相色谱中常遇见的问题及处理方法 （申请加分）1 色谱柱跑干了，处理方法:将贮液瓶装入重蒸水，首先按purge键,将柱前气柱排出，若无法排出，可将色谱柱前拆下，用注射器抽吸。待柱前气体排空后,连接色谱柱，用水高低流速交替冲洗色谱柱,直至柱压稳定为止。 2.基线不稳，有静电，处理方法:检查接地是否良好。 3。峰面积变化非常大,处理方法:检查是否进样阀堵塞. 4。基线突然提高,变粗，处理方法：检查样品池能量,若低于正

12、常值,说明检测器污染. 5.柱压变动范围较大，处理方法：多为进气泡.高低流速交替冲洗。 6。柱效或峰形突然变差，处理方法：更换预柱。 7塔板数低 ：色谱柱选择不对，二次保留、峰形不好的影响 8色谱柱易变性:色说柱选择不对,二次保留的影响 9色谱柱寿命短：色谱柱选择不对，样品需预处理(PH3或PH7） 10保留值变化：色谱柱平衡不够,流动相比例改变 11出现新的干扰峰：初始分离不够或初始样品无代表性 选择波长要从以下几个方面考虑： 1。 检测波长要大于溶剂截止波长。如果所选择的波长下溶剂有很强的吸收当然是不合适的。溶剂有强吸收后，基线抬高，减小检测的线性范围而且会加大基线噪声，对溶质的检测灵敏度

13、下降。 2。 对各组分都要有适当的吸收。一般是不可能做到的.所以只要选择一个对大多数组分都有较大吸收的波长就可以了。 3. 外标法定量时，要选择被测组份最大吸收波长。 254nm 对常见的共轭结构和羰基官能团都有吸收。对饱和基团也有弱的吸收。而对于常见的乙腈、甲醇的透过率很高。是在不知道用什么波长时最理想的试验波长。 （一）涡流扩散（Eddy diffusion） 流动相碰到较大的固体颗粒，就像流水碰到石头一样产生涡流。如果柱装填得不均匀，有的部分松散或有细沟，则流动相的速度就快；有的部位结块或装直紧密则流就慢,多条流路有快有慢，就使区带变宽。因此，固相载体的颗粒要小而均匀，装柱要松紧均一,这

14、样涡流扩散小，柱效率高。 （二）分子扩散（Molecular diffusion） 分子扩散就是物质分子由浓度高的区域向浓度低的区域运动，也称纵向分子扩散。要减少分子扩散就要采用小而均匀的固相颗粒装柱.同时在操作时，如果流速太慢，被分离物质停留时间长，则扩散严重。 （三）质量转移（Mass transfer） 被分离物质要在流动相与固定相中平衡,这样才能形成较窄的区带。在液相色谱中,溶质分子要在两个液相之间进行分配，或在固相上被吸附和解吸附均需要一定的时间。当流速快时，转移速度慢,来不及达到平衡动相就向前移，这各物质的非平衡移动，使区带变宽。 四）动相流速 当流速太低时，分子扩散严重,特别是在

15、气相色谱中尤为突出。如将理论塔板高度对流速作图，理论塔板高度随流速增加而急速下降,当达到最低值时，流速再加大则质量转移起主要作用，理论塔板高度又加大.在高效液相色谱中，流速稍快影响不大,但在凝胶过滤色谱中，因为物质要渗透到凝胶内部，所以质量转移影响大，流速咖大会降低柱效率。 五）固定相颗粒大小 定相颗粒越小柱效率越高，对流动相流动的阻力越大，需要加大压力才能使它流动。 1、开泵后压力即升高至最高限度，经过对色谱柱前,色谱柱,色谱柱后的分段测试，确定为检测池堵塞。 2、换检测波长后，色谱峰面积比以前做的小很多,怀疑进样环或管路漏夜，经检查，排除,最后确定为，检测波长的显示值和实际值不符。 由气味、景象和声音可以发现的问题 你需要运用你所有的感官去发现液相色谱的问题.你最好养成习惯,每天花上几分钟运用你的感官（除了味觉）来“感觉”你的液相色谱是否存在问题，这样可以帮助你迅速找到问题所在.例如：在你看到漏液之前，你可能首先闻到它的气味。大部分的问题是可以通过眼睛看到。 A、溶剂的气味 原 因解决方法 1、漏液1、见前 2、溅出2、a、检查废液瓶是否已满 b、找到溅出的部位并清洗干净 B、热气味 原 因解决方法 1、仪器过热1、a、检查并调节通风设施 b、检查并调节温度设定 c、关掉仪器，查找维修手册 C、读数不正常 原 因解决方法 1、压力不正常1、见前 2、柱温箱问题