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1、细胞凋亡实验步骤及注意事项细胞爬片制备详细过程肿瘤细胞侵袭实验细胞凋亡实验步骤及注意事项一、实验目的1、掌屋凋亡细胞的形态特征2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细 胞和坏死细胞的方法二、实验原理细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种 不同类型。凋亡普遍存在于生命界，在生物个体和生存中起着非常重 要的作用。它是细胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合， 是细胞遵循一定规律自己结束生命的自主控制过程。细胞凋亡具有可 鉴别的形态学和生物化学特征。在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触，细胞变园，细胞膜 向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状
2、或新月 状分布、内质网和细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡 小体，凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物 并不释放到细胞外，不会影响其它细胞，因而不引起炎症反应。在生物化学上，多数细胞凋亡的过程中，内源性核酸内切酶活化， 活性增加。核 DNA 随机地在核小体的连接部位被酶切断，降解为 180-200bp 或它的整倍数的各种片断。如果对核 DNA 进行琼脂糖电 泳，可显示以180-200bp为基数的DNA ladder （梯状带纹）的特征。相比之下，坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细 胞在坏死早期即丧失质膜完整性，各种细胞器膨胀，进而质膜崩解释 放出其中的内
3、容物，引起炎症反应，坏死过程中细胞核DNA虽也降解， 但由于存在各种长度不等的 DNA片断，不能形成梯状带纹，而呈弥散状。一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡，通常这 些因素在诱导凋亡的同时，也可产生细胞坏死，这取决于损伤的剧烈 程度和细胞本身对刺激的敏感程度。三尖杉酯碱(HT )是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病， 急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明 HT 在 0.025ug/ml范围内作用2小时，即可诱导HL-60细胞凋亡，并表现 出典型的凋亡特征。本实验用1Mg/ml HT在体外诱导培养的HL-60细 胞发生凋亡，同时也有少数细胞发生坏死。用 Hoechst
4、33342 和碘化 丙啶( propidium iodide ， PI )对细胞进行双重染色，可以区别凋亡、 坏死及正常细胞。细胞膜是一选择性的生物膜，一般的生物染料如 PI 等不能穿过质 膜。当细胞坏死时，质膜不完整， PI 就进入细胞内部，它可嵌入到 DNA或RNA中，使坏死细胞着色，凋亡细胞和活细胞不着色。而一些活细胞染料由于为 亲脂性物质，可跨膜进入活细胞，因而可进行活细胞染色。 Hoechst33342 是一种活性荧光染料且毒性较弱，它是双苯并咪唑的 种衍生物。与DNA特异结合(主要结合于A-T )碱基区)，显示凋 亡细胞和活细胞。凡是看到有凋亡小体的细胞都是凋亡细胞。三、实验用品1
5、、试剂：三尖杉酯碱(HT ),300pg/ml, 100mmol/L Tris- HCl(pH7.5)，5mol/L EDTA 缓冲液、碱性裂解液： 0.2mol/L NaOH, 1%SDS、醋酸钠：3mol/L KAc ( pH4.8 );异丙醇;70%乙 醇；溴酚蓝，蔗糖指示剂。TBE电泳缓冲液，1%琼脂糖，溴乙锭。PI 母液:500pg/ml; Ho33342 母液：2mmol/L。2、仪器设备：荧光显微镜，电泳仪，电泳槽，微量加样器( 1ml ， 100pl)0.5、1.5ml离心管，载玻片，盖玻片。四、实验材料人早幼粒白血病H L-60细胞，用含10%小牛血清的RPMI1640培 养
6、基在37弋，5%CO2条件下培养。五、方法步骤1、三尖杉酯碱诱发H L-6 0细胞凋亡(1 )实验前约24小时，接种两瓶HL-60细胞，标记、，每 瓶含约6ml培养液，置37弋，5%CO2培养箱培养。( 2 )实验前约2.5小时，当细胞密度达到70% ， 号瓶加入三尖 杉酯碱200|jl,使终浓度为1|jg/ml,号瓶中加入同等量 PBS (pH7.4 )作对照。共同放入培养箱中继续培养2.5小时。2、HO33342和PI双重染色鉴别三种细胞(1) 染色：将瓶中的细胞摇匀取200ml于1.5ml的离心管中，加 入HO33342母液2pl,PI 20pl,染色15分钟。(2) 滴片：取一载玻片用
7、双面胶围成一小室，从离心管中各取以 上染色后的细胞悬液10pl,加入小室内盖上盖玻片，荧光镜下用紫外 激发光，高倍镜下观察，区别三种细胞，并注意三者比例。注意事项1.诱导培养HL-60细胞时间要准确；2. 荧光显微镜下观察细胞时，由于荧光易碎灭，观察时要尽量快。其他细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死 两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界，在生物个体和生存中起着非 常重要的作用。它是细胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组 合，是细胞遵循一定规律自己结束生命的自主控制过程。细胞凋亡具 有可鉴别的形态学和生物化学特征。在形态上可见凋亡细胞与周围细 胞脱离接触，细胞变园，细胞膜向内
8、皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、 细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体，凋亡小 体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细 胞外，不会影响其它细胞，因而不引起炎症反应。在生物化学上，多数细胞凋亡的过程中，内源性核酸内切酶活化， 活性增加。核 DNA 随机地在核小体的连接部位被酶切断，降解为 180-200bp 或它的整倍数的各种片断。如果对核 DNA 进行琼脂糖电 泳，可显示以180-200bp为基数的DNA ladder (梯状带纹)的特征。相比之下，坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细 胞在坏死早期即丧失质膜完
9、整性，各种细胞器膨胀，进而质膜崩解释 放出其中的内容物，引起炎症反应，坏死过程中细胞核DNA虽也降解， 但由于存在各种长度不等的DNA片断，不能形成梯状带纹，而呈弥散 状。一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡，通常这 些因素在诱导凋亡的同时，也可产生细胞坏死，这取决于损伤的剧烈 程度和细胞本身对刺激的敏感程度。【爬片的准备】1. 爬片可用一般的盖玻片，也可用专用爬片；2. 应用盖玻片，可根据自己的需要剪裁成合适的大小，以备置于6 孔板、12 孔板或 24 孔板；裁剪时可用前护士输液用于打开玻璃安瓶 的小沙轮，或者是口腔科的那种小沙轮，轻轻划一下后，稍用力一掰 就分开了。如果接种大皿
10、的话，我一般不将盖玻片切开，直接清洁后放入培 养皿中，到染色时再将之切开，这样既保证了细胞均一性，又可同时 做几个指标的染色。3. 将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来 水冲洗 20 遍，再置于无水酒清中浸泡 6 小时，再用三蒸水冲洗 3 遍 （个人认为主要目的是将酸冲洗干净就可以了，如果不干净的话，细 胞帖壁不好），放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒。4. 高压后取出放入烤箱中烤干，备用。烤干后可放入超净台中。5. 关于多聚赖氨酸，很多人都将玻片用此处理，以使细胞与玻片 结合更牢。但我在做爬片时从来没用过多聚赖氨酸，细胞贴壁仍然很 好，且在做后续的免疫细胞化学染色、
11、TUNEL等凋亡检测、免疫荧光 等也从未脱过片。【细胞爬片】1. 胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。2. 加细胞时，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置 滴少量培养基，目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起， 然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。整个 过程注意无菌操作。3. 根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可4. 待细胞贴壁后，可去上清加含药培养基。5. 按照实验设计，作用一定时间后取玻片。取玻片时由于玻片与 培养皿底结合较紧，张力较大，我一般将注射器针头针尖向背面弄个 小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出就可以了。如果要做诸如 24h
12、，48h，72h 等这样时间点的实验的话，将所需数量的爬片取出时 应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。末取出的可接着继续培养。【细胞爬片的固定】细胞爬片取出后，一般用 PBS 洗 2 遍，然后再做固定。当然，根 据研究目的，PBS洗也不是一定要做的，比如做凋亡的TUNEL染色时 就避免洗，因为凋亡的细胞在洗的过程中有可能会脱落。另外在保存细胞爬片的时候，我一般用培养皿或板，先在皿底放 一层面巾纸，然后再放爬片，这样方便做实验时取片。然后盖上盖子， 并在盖子上做标记，为避免混淆，可用透明胶带将盖子和皿连在一起。 般-20弋保存2-3个月的片子做免疫组化是没有问题的。以下为常用的固定液1. 冷丙酮可用
13、于一般的免疫组化染色。将纯的丙酮预先放入冰箱-20C后便为冷丙酮（放心，丙酮在此温 度不会为固体的）细胞爬片取出后,PBS洗2遍，便可加入冷丙酮于- 20C（丙酮有很强的挥发性，注意将含有丙酮和爬片的器皿盖严，防 止其挥发）固定10分钟。取出后，室温吹干，然后放入-20C保存。2. 多聚甲醛（常用 4%）：可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光以及 TUNEL 染色。主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗 原，例如各类淋巴细胸分化决定簇（CD）、主要组织相容性抗原等室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20C保存3. 95乙醇，可用于免疫组化。优点：穿透性强、抗原性保存较好。缺点：但醇类
14、对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较 差，使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间 长，抗原可流失而减弱反应强度室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20弋保存4. 甲醛（福尔马林）应用最广 优点：形态结构保存好，且穿透性强， 缺点：甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色； 分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使 之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。肿瘤细胞侵袭实验（Tumour Invasion Assay）肿瘤细胞侵袭实验（Tumour InvasionAssay ）可以：（1）研究 各种细胞因子对恶性肿瘤细胞侵袭和转移的影响
15、；（2）一些抑制血管 生成的新药研究；（3）研究肿瘤细胞侵袭和转移机制。实验方法Matrigel基质膜模型实验方法原理 Matrigel 是从小鼠 EHS 肉瘤中提取的基质成分， 含有 LN 、IV 型胶原、接触蛋白和肝素硫酸多糖，铺在无聚乙烯吡硌 烷酮的聚碳酸酯滤膜上，能在DMEM培养基中重建形成膜结构，这种 膜结构与天然基质膜结构极为相似。滤膜孔径一般为 8um ，而且膜孔都被 Matrigel 覆盖，细胞不能 自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过这种铺有 Martrigel 的滤膜，这与体内情况较为相似。铺有Martrigel的滤膜放在以Blind Well腔或MICS腔上下
16、室之 间，铺有 Martrigel 面朝向上室，在下室中加有趋化剂，如一定浓度 的LN、FN或小鼠3T3条件培养液或人睾丸上皮成纤维细胞培养液， 上室加入重悬的瘤细胞，具有侵袭能力的细胞在趋化剂诱导下开始穿 膜运动。细胞穿膜所用的时间与 Martrigel 的用量有关，选择 25ugMartrigell铺膜，16小时后观察结果较为合适。穿过滤膜的细胞 多数粘附在滤膜下表面，可用棉签将上表面的细胞拭去，然后用乙醇 固定滤膜，PE染色，在光镜下观察统计穿过Martrigel的细胞数。另 外用 Transwell 小室也可进行重建基质膜侵袭分析，这一方法是在 Transwell 小室吊篮式上腔的滤膜上铺上 30ugMartrigel ，加入细胞 72h后观察结果。值得注意的是，细胞在Trans
