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1、茶藨子叶状层菌固体培养特性研究了 6种不同培养基对茶藨子叶状层菌(Phylloporia ribis)菌丝形态、生 长速度、生物量及三萜含量的影响。结果表明：茶藨子叶状层菌菌丝体在麦芽汁、 胡萝卜和PDA固体培养基中生长速度较快，在麦麸与PDA固体培养基中生物量 较高，而在生长速度最慢的GPY固体培养基中，三萜含量最高。茶藨子叶状层菌； 固体培养； 培养特性； 三萜茶藨子叶状层菌(Phylloporia ribis)为锈革孔菌科(Hymenochaetaceae)叶 状层菌属(Phylloporia)真菌，发现于山东省平邑县，寄生在当地金银花树活体 根茎韧皮部，当地人称之为“银花蛾子”。茶藨子
2、叶状层菌子实体的功效与金银花 有相似之处，可用于消炎、解毒、止痛，当地居民用其治疗咽炎、喉炎、肝炎及 癌症，有良好的临床治疗效果，具有很大的药用开发价值 1。由于受寄主和产 地的限制，野生茶藨子叶状层菌采集量很低，限制了对其进一步的开发与利用， 目前对它的研究主要集中在采集的野生子实体活性成分分析，而对于其人工培养 方面的研究较少，因此，探讨其固体培养特性可为其下一步大规模人工培养奠定 基础。1 材料与方法1.1 标本与菌种野生茶藨子叶状层菌(P. ribis)采集于山东省平邑县郑城镇西山的金银花树 上(封三图 1)，子实体形状不规则，呈扁平状半圆形，菌盖表面粗糙，硬而韧， 木质化，瓦状叠生排
3、列，深棕色至浅栗色，有同心环状棱纹似年轮及细微绒毛， 菌盖长为36 cm，宽为1.53.5 cm，无菌柄，子实体背面暗褐色，肉眼可见细 小的管口，管口浅褐色至暗褐色，断面可见菌肉呈木质化的纤维质，棕黄色，菌 管长12 mm。经吉林农业大学菌物研究所图力古尔教授鉴定，该标本为茶藨 子叶状层菌。采用组织分离法分离菌种，将新鲜子实体标本用大量无菌水冲洗至 表面无泥沙杂物，再用 75%的酒精擦拭表面，将菌盖纵剖为二，用尖头镊子从剖 面上取5 mmx5 mm的菌肉组织，置于PDA平板，25 C下暗培养，选取生长良 好的菌丝，转接到PDA平板，反复纯化，选取生长健壮的菌丝转接至试管斜面 PDA培养基，4
4、C冰箱保存。图 1 野生茶藨子叶状层菌子实体Fig.1 Wild P. ribis fruiting bodies1.2培养基麦芽汁固体培养基(g/L)： 50麦芽汁，15琼脂。胡萝卜固体培养基（g/L）： 200胡萝卜（煮汁），20葡萄糖，15琼脂。麦麸固体培养基（g/L）： 30麦麸（煮汁），20葡萄糖，3 KH2PO4, 1.5 MgS04, 15琼脂。GPC固体培养基（g/L）： 20葡萄糖，6蛋白胨，10玉米浆，15琼脂。PDA固体培养基（g/L）： 200马铃薯（煮汁），20葡萄糖，15琼脂。GPY固体培养基（g/L）： 20葡萄糖，6蛋白胨，10酵母膏，15琼脂。1.3菌种鉴定参
5、照 MAKIMURA 等2的方法分别提取茶藨子叶状层菌子实体样品（削去 子实体表层，取内部组织）DNA和菌丝体DNA。按照刘贵巧等的方法扩增ITS 序列，采用真菌 ITS 通用引物 ITS1： 5 TCCGTAGGTGAACCTGCGC3ITS4： 5 TCCTCCGCTTATTGATATGC3，扩增ITS全长序列，每个样品5个重复，3次测序，得到的扩增产物送往华 大基因股份有限公司测序。陈蒙蒙，等：茶藨子叶状层菌固体培养特性1.4菌丝体培养将1.2中的6种固体培养基分别倒入平板，凝固后铺上已灭菌的单层玻璃纸 （上海金穗生物科技有限公司产品，用时将0.5 mx0.5 m的玻璃纸剪成平板内径 大
6、小的圆形），将菌种转接到PDA平板上活化，采用直径为6 mm的打孔器在生 长良好的菌落边缘处取菌块，分别接种于不同培养基内，26 C、避光培养，观 察菌落生长情况及菌落特征，从第20天开始每隔10 d记录菌落直径，到60 d 时结束，每种处理3个重复。1.5菌丝体生物量和三萜含量测定将每个阶段（20、30、40、50和60 d）的茶藨子叶状层菌菌丝体从培养基 表面的玻璃纸上刮下，每种培养基3个重复，称量湿重，然后置于60 C烘箱中 烘干至恒重，测其干重即为生物量。按照参考文献的方法制作标准曲线，三萜标准品为齐墩果酸（98%，上 海源叶生物科技有限公司）。样品溶液制备：将烘干至恒重的茶藨子叶状层
7、菌菌丝体研磨，精确称取0.5 g 粉末，用95%的乙醇溶液定容至50 mL，用超声波（42 kHz左右）室温提取2 h， 4800 g离心10 min，取上清液。样品溶液测定：各取 3 份 0.3 mL 样品溶液至试管中，按标准曲线制作方法 在波长550 nm处测定吸光度(A)值，根据标准曲线计算菌丝中三萜含量。1.6 统计学处理采用 SPSS17.0 进行单因素方差分析。2 结果与分析2.1 菌种鉴定经过测序，茶藨子叶状层菌子实体样品ITS序列与分离纯化后的菌种ITS序 列完全一致，确定该菌种为茶藨子叶状层菌。2.2 菌丝体形态和生长特性此菌在6种培养基上菌丝生长均较缓慢，培养60 d时菌丝
8、未能覆盖满平板, 在麦芽汁、PDA、GPC和胡萝卜培养基上菌丝生长比较旺盛；在麦麸培养基上 30 d 变色，最快，而在麦芽汁、 PDA、 GPC 和胡萝卜固体培养基上变色较慢；6 种固体培养基上的生长速度排序为麦芽汁、胡萝卜、PDA、GPC、麦麸和GPY (表 1 )。1：麦芽汁固体培养基； 2：胡萝卜固体培养基； 3：麦麸固体培养基； 4： GPC固体培养基；5： PDA固体培养基；6： GPY固体培养基；+：微弱；+： 强壮 Growth recorded after 60 d incubation. 1： Malt liquor agar medium( malt liquor cont
9、aining 5.0% solids )；2： Carrot medium ( liquor from boiling 200 g/Lcarrots+20 g/L glucose)； 3： Wheat bran medium ( liquor from boiling 30 g/L wheat bran+20 g/L glucose+3 g/L KH2PO4+1.5 g/L MgSO4 )； 4： GPC (g/L)(20glucose+6 peptone+10 corn starch )；5： Potato dextrose agar( g/L)( liquor fromboiling 20
10、0 g/L potato+20 g/L glucose )；6： GPY medium ( g/L，20 glucose+6peptone+10 yeast extract) .All medium contained 15 g/L agar. +： weak； +： strongy and t refer to DNA from fruiting body and mycelium， respectively图2茶藨子叶状层菌的子实体ITS序列和菌丝体ITS序列Fig.2 ITS sequences from P. ribis mycelium and fruiting body2.3 菌丝
11、体生物量和三萜含量接种后的2030 d,菌丝体生长较缓慢，为延滞期，3050 d,生长较快， 为对数生长期，50 d之后，生物量开始降低，为衰亡期，培养到第50天时，麦 麸固体培养基的菌丝体生物量最大，平均干重为84.2 mg，同期，菌丝体生物量 从大到小的固体培养基依次为PDA、GPC、胡萝卜、麦芽汁和GPY （图2）。图2 茶藨子叶状层菌菌丝体在不同培养基上的生物量Fig.2 P. ribis mycelial biomass productionon different media根据齐墩果酸的质量和测得的A值，得回归方程：Y=14.69X+0.041。培养 60 d 以内的菌丝体，从图
12、 3 的趋势线可以看出，茶藨子叶状层菌中三 萜含量有两种趋势：一种为随时间延长，三萜含量越来越高，主要有麦芽汁、麦 麸、 GPC 和胡萝卜固体培养基；另一图3 茶藨子叶状层菌菌丝体中三萜含量的变化Fig.3 Triperpenoid content of P. ribis myceliagrown on different media种是随时间延长，三萜含量先升高后降低，主要是GPY固体培养基。第40 天时，GPY固体培养基培养的菌丝体中三萜含量为0.39%，已经比第60天的其 他培养基都高，具有较明显的优势；然后依次为第60天的胡萝卜、麦麸和GPC 固体培养基。亭亭，将“ Malt juic
13、e ”替换为“ Malt liquor”（同样的处理在表4）亭亭，Y轴改为“菌丝体生物量（干重）（mg） ”Mycelial biomass（ dry weight）（ mg）3 小结固体培养条件下，茶藨子叶状层菌在PDA、麦芽汁和胡萝卜固体培养基上 生长更快，但麦麸固体培养基菌丝体生物量最高，其次依次是PDA、GPC、胡 萝卜、麦芽汁和GPY固体培养基。茶藨子叶状层菌40 d的GPY固体培养基三 萜含量比60 d的胡萝卜固体培养基中高，然后依次为60 d的胡萝卜、麦麸和GPC 固体培养基。程书华.忍冬茶藨子叶层孔菌生药学研究D.济南：山东中医药大学，2012.2 MAKIMURA K， MURAYAMAYS， YAMAGUCHI H. Detection of a wide range of medically important fungal species by polymerase chain reaction （PCR）J. J Med Microbiol， 1994， 40：358364.3 刘贵巧，何华奇，王建明. 一株野生食用菌株的种类鉴定研究 J. 北方 园艺， 2014(12)：118121.4 陈飞，马闽卉，梁运祥，等. 不同品种灵芝固态发酵菌丝体多糖和三萜 含量的比较J.食品科技，2011,36 (9)： 1922.
