《中性粒细胞分离实验步骤》由会员分享，可在线阅读，更多相关《中性粒细胞分离实验步骤（3页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、一、中性粒细胞初步分选试剂与耗材：人淋巴细胞分离液、RP1640、15ml离心管4支，棉球，止血带、碘伏、 采血针，5mlEDTA抗凝采血管2支。1ml枪及枪头。分离步骤：1. 所有试剂恢复至室温；2. EDTA抗凝采血管收集人外周血10ml;3. 分别将5ml外周血加入5ml人淋巴细胞分离液中（15ml离心管中进行）；注意动作 轻柔缓缓加入；4. 500g 离心， 30-35 分钟，室温；5. 离心后收集低带中性粒细胞，分两层，第一层为单核细胞，第二层为中性粒细胞；（若离心后分层不明显则多离心 5-10 分钟）6. 将 RP1640 用纯水稀释为 50%RP1640 用于重悬中性粒细胞，恢复
2、细胞活性。（5-10 分钟）7. 400g 离心 10 分钟，去上清，收集中性粒细胞，重悬于 RP1640 中，细胞计数。二、中性粒细胞磁珠分选试剂耗材及设备：磁力分选器，磁柱， CD15 磁珠试剂盒，磁珠分选缓冲液 50ml， RP1640， 1ml 枪及枪头， 20 微升枪与枪头， 15ml 离心管 4 支，细胞计数板。步骤：1. 制冰，保证磁力分选器可以放入冰盒内操作，在4-8C内进行分选；2. 配液磁珠分选缓冲液（50ml PBS液中含2mmol/L EDTA，05%BSA，PH=72）；3. 将上步初步分选的中性粒细胞悬液 300g 离心 10 分钟，去上清；4. 细胞重悬于磁珠分选
3、缓冲液中， 107 细胞重悬于 80 微升缓冲液中；（如细胞数多按 倍数增加）5. 107细胞中加入20微升CD15磁珠；充分混匀放入2-8C避光孵育15分钟；6. 用 1-2ml 缓冲液洗涤细胞/107细胞， 300g 离心 10 分钟，去上清；7. 重悬细胞于缓冲液中， 108细胞重悬于 500 微升缓冲液中；8. 将磁力分选器置于冰盒中，用 3ml 缓冲液冲洗磁柱；9. 将含有中性粒细胞的缓冲液加入磁柱中；10. 用缓冲液冲洗磁柱，每次3ml，冲洗3次；11. 除去磁场，把磁柱放置于 15ml 离心管上，用 5ml 缓冲液加压快速冲洗磁柱；12. 离心管中收集的便是中性粒细胞；13300
4、g离心去上清，重悬细胞于10ml细胞培养液中，细胞计数。三、细胞活力检测步骤：1、4%台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml,用滤纸 过滤 4 度保存。使用时。用 PBS 稀释至 0.4%。2、胰酶消化贴壁细胞,制备单细胞悬液,并作适当稀释。3、染色：细胞悬液与 0.4%台盼蓝溶液以 9:1 混合混匀。（终浓度 0.04%）4、计数：在三分钟内,分别计数活细胞和死细胞。5、镜下观察,死细胞被染成明显的蓝色,而活细胞拒染呈无色透明状。6、统计细胞活力：活细胞率（）=活细胞总数/ （活细胞总数+死细胞总数）X100%四、细胞分组铺板给药试剂耗材及设备：六孔板 2 个,
5、1ml 枪及枪头, 20 微升枪与枪头, 15ml 离心管 4 支, 细胞计数板。1. 10ml外周血大概可分出1X107个细胞；2. 分为 10 组：单 PI 组单 AV 组PI、AV、CD15三染组空白组PI、AV双染组 LPS1pg/ml 组 LPS+Nec-1 50gg/ml 组 LPS+Nec-1 5pg/ml 组Nec-1 50gg/ml 组 Nec-1 5gg/ml 组。3铺板，每孔1ml细胞悬液，给药，空白组给予DMSO。（LPS浓度选择1pg/ml,因为 此浓度刺激中性粒细胞后出现凋亡率较低,坏死率较高。 Nec-1 浓度作用于神经细胞为7pg/ml-50pg/ml)五、细胞凋亡率检测耗材试剂： 1ml 枪及枪头， 20 微升枪与枪头， 1.5ml 离心管 15 个，凋亡检测试剂盒， CD15 抗体。1. 细胞培养一段时间后（3、6、12、24、36小时），离心（2000rpm离心5min）收 集细胞；2. 用PBS洗涤细胞二次（2000rpm离心5min） 收集 15x105细胞；3. 加入500uL的Binding Buffer悬浮细胞；4. 加入5uL AV混匀后，加入5 uL PI,混匀；5. 室温、避光、反应515min；6. 上机检测，分析结果。
