沙眼衣原体感染的实验室诊断

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1、沙眼衣原体感染的实验室诊断沙眼衣原体（CT）是性传播疾病的主要病原体之一，CT导致的盆腔炎性疾病和性传播疾病呈逐年上升的 趋势，CT感染可造成流产、不孕、围产期感染和胎儿宫内感染等。继1907年，捷克学者Halberstaeder和 Prowazek发现沙眼包涵体，1956年我国学者汤飞凡等分离沙眼衣原体成功之后，引起了全世界对其进行广泛 深入的研究1。目前实验室诊断方法基本上可分为细胞生物学检测方法、分子生物学检测方法和免疫学检测方法。1细胞生物学检测方法1.1涂片镜检法CT寄生于柱状上皮细胞内形成包涵体，取宫颈或尿道标本涂片后，通过碘染色或姬姆 萨染色等可见细胞内包涵体。但由于泌尿生殖道中

2、完整细胞较少，以及细胞内包涵体脆性较大，从而造成敏 感性过低，不推荐用于临床标本的检查。1.2细胞分离培养法 是目前诊断CT感染最可靠的方法。自20世纪70年代应用以来，一直作为评价其他 非培养法的“金标准”。但由于CT的专性细胞寄生性，一般培养法不能使其生长，只有在活的细胞内才能 增殖、复制。组织细胞培养法分离CT多采用McCoy细胞或Hela-229细胞（国内也有报道采用Hep-2细胞）， 染色后在显微镜下观察细胞内有无包涵体。CT培养法的敏感性为80.0%90.0%,特异性为100.0%。细胞培养 法虽然特异性好，可靠性强，但是由于分离培养操作复杂，技术及设备要求高，所需时间长，且敏感性

3、受标 本采集、运送、保存等的影响较大2，加上国内很多医院不具备细胞培养条件，因而不适于临床应用，多 用于科研和疑难病例的终鉴定。目前通常仅作为其他实验室方法可靠度的参照标准。但是DNA扩增法的出现， 使得这一观点已有所改变。2免疫学检测方法2.1血清抗体检测尽管沙眼衣原体感染时血清和泌尿生殖道分泌液中会出现抗体，但血清学试验对于 诊断无并发症的泌尿生殖道感染价值不大。免疫反应为期短暂，且再感染常有发生。血清抗体在性病高危人 群中有较高的本底检出率。不过，在性病性淋巴肉芽肿（LGV）和沙眼衣原体性附睾炎、输卵管炎时血清抗 体水平明显升高，检测血清抗体水平有助于诊断。新生儿衣原体肺炎也可用血清学方

4、法测定抗衣原体IgM抗 体，具有诊断价值。方法有酶联免疫吸附试验和微量免疫荧光法。当抗体滴度达一定水平时，提示有并发症 （附睾炎或输卵管炎），或为LGV。由于沙眼衣原体感染后血清阳转需23周时间，因此抗沙眼衣原体IgG 检测阴性不能完全排除感染。而病人即便经治疗后，IgG升高仍能持续较长时间，故阳性结果也不一定证明 有感染存在。2.2酶免疫测定（EIA）用酶标记的单克隆或多克隆抗体检测CT的LPS或M0MP,酶反应生成有色产物 用酶标仪进行测定。目前有Chlamydiazyme、ID-EIA、Pharmacia Chlamydia EIA等多种市售诊断试剂盒可 供使用。其敏感性从64%到98%

5、,特异性从93%到98% 3。通常认为，其敏感性在高危人群中可得到满意结果， 而在新近感染及治疗监测中敏感性明显降低。EIA的优点在于方法简便、操作自动化，适于短时内大批量标 本的检测。但其最大缺点在于，与其他常见微生物能产生交叉反应，如金黄色葡萄球菌、A群及B群链球菌、 淋病奈瑟菌、醋酸钙不动杆菌、肺炎克雷伯菌及其他革兰阴性细菌，而出现假阳性，使特异性达不到100%。 国外此法多用于高危人群的筛查，国内应用较少。2.3直接荧光抗体测定（DFA）将针对CT的单克隆抗体用荧光标记，与标本中的CT结合后，荧光显微 镜检查就能见到发荧光的原体（Ebs）。针对脂多糖（LPS）的抗体荧光不够亮，且染色不

6、匀；而针对主要外 膜蛋白（MOMP）的抗体荧光更亮，且减少非特异染色4。DFA不象培养法必须存在有活力的CT,但其敏感 性受人群感染率的影响，它最适宜用来检测沙眼衣原体高流行率人群（如性病门诊病人）。其缺点是在低感 染率的人群中敏感性差，受实验人员的主观判断影响较大。由于此法操作简便、费用低廉，在不具备分子生 物学试验条件的医院，可用以检测临床标本5,但也需经验丰富者操作。3分子生物学检测方法3.1直接检测核酸的技术（即基因探针技术）此技术利用核酸分子的复性原理，用特定的标记探针去 检测标本中的靶核酸。最初为放射性标记，后来逐渐发展为酶或化学发光试剂标记。目前有美国圣地亚哥Gen-Probe公

7、司生产的发光标记基因探针试剂盒PACE-2。与培养法相比，Gen-Probe方法的敏感性和特异性 分别为73%96%和98%99%,尚无培养法敏感和特异。由于此法成本高、步骤繁琐，随着核酸扩增技术的出 现，基因探针技术也就失去了其应用价值。3.2核酸扩增技术 继基因探针技术之后，很快出现了核酸扩增技术，这些技术包括:（1）靶DNA或RNA 的扩增，如聚合酶链反应（PCR），基于转录的扩增（TBA）,自动维持序列扩增（3SR）以及链置换扩增（SDA）；（2）探针扩增，如连接酶链反应（LCR）, Q-0复制酶的扩增；（3）杂交后信号的扩增，如复合探针和分支 DNA探针。其中研究和使用较多的是PCR

8、和LCR，尤其是PCR技术，对感染诊断引起了革命性变化6。PCR是1985年建立的一种体外扩散特异DNA片段的技术，Dutilh等首先报道应用PCR检测细胞培养物中 的CT,此后多种诊断CT感染的PCR方法相继建立，PCR具有高度敏感性和特异性，重复性好并易于自动化， 可检测少量DNA （相当于13个原体）。据报道，在抗生素治疗后，培养法检测可立即呈阴性，而PCR在2周 内仍可得出阳性结果，引物是决定PCR特异性的主要因素。目前报道的引物序列多选自衣原体的M0MP基因、 rRNA基因和内源质粒，rRNA基因较为保守，多用于构建衣原体属特异性引物，一般认为质粒PCR较MOMP PCR 更敏感。P

9、almer等报告MOMP PCR检测初段尿的敏感性为82.0%,特异性为94.0%;Mahony等报道质粒PCR检 测初段尿的敏感性和特异性均可达100.0%;连接酶反应（LCR ）为1989年建立的另一种核酸扩增方法。1995 年LCR在美国获准用于CT的检测。Abbott公司已率先向市场投放利用LCR诊断CT感染的LCX试剂盒。LCR 和EIA检测初段尿的敏感性分别为96.3%和37.0%, EIA和培养法检测宫颈拭子的敏感性分别为55.6%和78.3%, 而培养法为56.3%, EIA仅为18.8%，特异性均为100.0%, LCR只扩增含需寻找的精确序列的DNA,因而具有很 高的特异性

10、，但敏感性不如PCR。PCR实验在操作时，尤其要避免外界污染及残留污染，以免发生假阳性。 PCR的开展需要一定的实验条件，实验人员需具备较为熟练的分子生物学操作技术。最好在实验条件较为成 熟的实验室开展。综上所述，随着社会的日益开放，衣原体导致疾病的范围已逐渐扩大到多个临床学科，一方面是衣原体 已成为性传播疾病中最常见的一种病原体，另一方面它可形成严重的持续感染。结合实际情况，泌尿生殖道 CT感染的实验诊断中，经典的细胞培养方法虽然特异性强，但耗时长、费用大，且不够敏感；免疫学方法简 便快捷，在基层医院具有实用性；具有核酸扩增技术的PCR和LCR等检测方法能满足特异性，敏感性均高且 快速检测的需要，而且可检测各发病率人群。但这些实验要求具备高精的仪器和熟练的技术，且试剂价格昂 贵，不太适合大量人群的普查；总之，CT感染的诊断目前已发展到分子生物学水平，随着科学技术的不断进 步，必将出现新的检测技术，以便更准确、快速地对CT感染作出诊断。