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1、实验七 叶绿体色素的提取及理化性质的鉴定一、目的1、学习应用提取分离叶绿体色素的实验方法。2、验证叶绿素的理化性质。3、了解叶绿体色素的荧光现象、皂化反应等理化性质。二、原理1、叶绿体色素：植物叶绿体色素主要有三类：1）叶绿素 2）类胡萝卜素 3）藻胆素。高等 植物叶绿体中含有前两类，藻胆素仅存在于藻类植物中。高等植物体内叶绿素（chlorophyll两种）主要有两种：叶绿素a、b （简写为chia、chib，其 结构式见图7-3），chia通常呈蓝绿色，而chib呈黄绿色，chib是chia局部氧化的衍生物。 chia是chib的三倍，二十世纪30年代，知道了叶绿素的分子结构，50年代末期，
2、人工合成 了叶绿素a,其它色素也几乎在同时发现。叶绿体中的类胡萝卜素主要包括胡萝卜素（carotene）和叶 黄素（lutein）两种，前者呈橙黄 色，后者呈黄色。叶黄素是胡萝卜素的二倍。一般植物叶绿素是类胡萝卜素的三到四倍； 胡萝卜素：C40H56 （有a、B、Y三种同分异构体） 叶黄素： C40H54（OH） 2 （同分异构体很多）。2、理化性质：这二大类四种色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，如乙醇、丙酮等。通常用 80%的丙酮或丙酮：乙醇：水为4.5： 4.5： 1的混合液来提取叶绿素。按化学性质来说，叶绿素是叶绿酸的酯，在碱的作用下，可使其酯键发生皂化作用，生成叶 绿酸的盐，能溶于水，但
3、由于它保留有Mg核的结构，仍保持原来的绿色。而类胡萝卜素中， 胡萝卜素是不饱和的碳氢化合物，B 胡萝卜素水解可生成2分子维生素A,叶黄素是由胡 萝卜素衍生的二元醇，不能与碱发生皂化反应，根据这一点，可以将叶绿素和类胡萝卜素分 开。此外，叶绿素还可以在酸的作用下，其中的Mg被H所代替形成褐色的去Mg叶绿素： 去Mg叶绿素能与其他金属盐中的铜、锌、铁盐等代H,又重新呈现绿色，比原来的绿色更 稳定。根据这一原理可用醋酸铜处理来保存绿色标本。3、功能：1叶绿体色素的功能 叶绿素和类胡萝卜素都包埋在类囊体膜中，与蛋白质结合在一起，组成色素蛋白复合体， 根 据功能来区分，叶绿体色素可分为二类：（1）作用中
4、心色素：叶绿素分子含有一个卟啉环的“头部”和一个叶绿醇的“尾部，”呈蝌 蚪型，大卟啉环由四个小吡咯环以四个含有双键的甲烯基（CH=）连接而成。镁原子居于卟 啉环的中央，偏向于带正电荷，与其相联的氮原子则偏向于带负电荷，因而其“头部”具有 极性，是亲水的，可以与膜上的蛋白质结合；而其“尾部”是叶绿酸的双羧基被甲醇和叶醇 所酯化后形成的脂肪链，具疏水亲脂性，可以与膜上的双卵磷脂层结合，因此，这决定了叶 绿素分子在类囊体膜上是有规则的定向排列。极少数具特殊状态的 chia 分子，其卟啉环上 的共轭双键易被光激发而使电子与电荷分离，引起光能转化为电能的重要反应，因此这些 chia 分子是光合作用的重要
5、色素，称“作用中心色素”；（2）天线色素（聚光色素）：没有光化学活性，只有收集光能的作用，包括大部分chia和 全部chib、胡萝卜素、叶黄素。这些色素排列在一起，象漏斗一样，把光传递集中到作用中 心色素，引起光化学反应。类胡萝卜素还是一种保护性色素，在光过强时，可耗散过剩激发 能，消除活性氧自由基，防止光合器官被氧化损伤。3、形成条件：叶绿素的形成叶绿素在植物体内，能不断的进行新陈代谢，如菠菜的叶绿素72 小时更新95.8%；烟草 19 天后更新 50%，其合成与分解受植物遗传控制（如吊兰叶的白边），也与环境关系密切。高等植物的叶绿素形成可以分为两个阶段，第一个阶段：主要是由a-酮戊二酸（或
6、由其和 氨形成的谷氨酸）经过一系列复杂的生化反应合成叶绿素的前身物质无色的原叶绿酯；第 二个阶段：原叶绿酯在光下被还原，成为绿色的叶绿素。叶绿素形成的条件1光照 光是叶绿素形成的必要条件，原叶绿素必须经过光照后才能合成叶绿素。缺乏光照 或其他某些条件，影响叶绿素形成，使叶子发黄的现象，称黄化现象。由于黄化部位，机械 组织不发达，肉质细嫩，生产上常用于遮光培育韭黄、蒜黄、葱白等；而光太强对叶绿素也 不利，会使叶绿素氧化、褪色、去镁，并形成对膜有害的自由基。有些植物或植物部分无光照条件也能形成叶绿素，如松、柏，莲子胚芽等，推测这些植物中 含有代替可见光促进叶绿素合成的物质。2温度 温度主要通过影响
7、叶绿素合成酶的活性而影响叶绿素的合成。一般叶绿素形成的最 低温度为24C,最适26-30C左右，最高约40C。早春植物幼芽、叶呈黄绿色，是低温 影响了叶绿素的形成的缘故。3.矿质营养矿质元素对叶绿素形成也有很大影响。N和Mg是叶绿素的组成成分，Fe、Mn、Cu、 Zn 等在叶绿素合成过程中也是必不可缺少的元素，缺少这些元素会引起缺绿症。特别 是氮素，植株体内氮水平高低可影响叶绿色的深浅，生产上以此来判断氮肥的丰缺。4水分和氧气植物缺乏水和O2,不仅抑制叶绿素的形成，还会促进原有叶绿素的分解。 所以严重高温、干旱缺水和涝害缺O2时，叶子常表现黄色褪绿现象。由于叶绿素的形成受许多条件的影响，所以叶
8、色是反映植物的营养情况和健康状况的一个很 灵敏的指标，成为肥水管理和调控作物生长发育的依据之一。5、提取：叶绿体色素为有机酯类化合物，根据相似相容原理，常用有机溶剂提取。如酒精、 丙酮、乙酸乙酯、氯仿等。分离：薄层层析法是将吸附剂均匀的涂抹在玻璃板上形成一薄层，将此吸附剂薄层作为固定 相，把待测分离的样品溶液点在薄层板的下端，然后用一定量的溶剂作流动相，将薄层板的 下端浸入到展开剂中。流动相通过毛细管作用由下而上逐渐浸润薄层板，并带动样品在板上 也向上移动，样品中各组成分在吸附剂和展开剂之间发生连续不断的吸附、脱吸附、再吸 附的过程。由于吸附剂对不同物质的吸附能力大小不同，吸附能力强的物质相对
9、移动慢 一些，儿媳妇能力弱的物质相对移动快一些，从而使各组分有不同移动速度而彼此分开。叶绿体中含有绿色素（包括叶绿素a和叶绿素b）和黄色素（包括胡萝卜素和叶黄素）两大 类,这两类色素都不溶于水,而溶于有机溶剂,故可用乙醇或丙酮等有机溶剂提取.提取液可用色层分析的原理加以分离.因吸附剂对不同物质的吸附力不同,当用适当的溶剂推 动时,混合物中各成分在两相（流动相和固定相）间具有不同的分配系数,所以它们的移动速 度不同,经过一定时间层析后,便将混合色素分离.叶绿素是一种二羧酸叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯,故可与碱起皂化反应而生成 醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿酸的盐,产生的盐能溶于水中,可用此法将叶绿
10、素与类胡萝卜素分 开；叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性,叶绿素吸收光量子而转变成激发态,激发态的叶绿 素分子很不稳定,当它变回到基态时可发射出红光量子 ,因而产生荧光.叶绿素中的镁可以被 H+所取代而成褐色的去镁叶绿素,后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在 光下不易破坏,故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。6、叶绿素是一种有叶绿酸与甲醇形成的复合酯，故可发生皂化反应。叶绿素化学性质不稳 定，见光分解。叶绿素中的Mg可以被H+代而形成褐色的去镁叶绿素，去镁叶绿素遇铜则 变成铜带叶绿色。纸层析法测定叶绿素 纸层析是用滤纸作为载体的一种色层分析法，其原理主要是利用混合物中各组分在；
11、流动相 和固定相的分配比（溶解度）的不同而使之分离。滤纸上吸附的水为固定相（滤纸纤维常能 吸 20% 左右的水），有机溶剂如乙醇等为流动相，色素提取液为层析试样。把试样点在滤纸 的滤液细线位置上，当流动相溶剂在滤纸的毛细管的作用下，连续不断地沿着滤纸前进通过 滤液细线时，试样中各组份便随着流动相溶剂向前移动，并在流动相和固定相溶剂之间连续 一次有一次的分配。结果分配比比较大的物质移动速度较快，移动距离较远；分配比较小的 物质移动较慢，移动距离较近，试样中各组分分别聚集在滤纸的不同的位置上，从而达到分 离。 叶绿素等是脂溶性的有机分子，根据相似相溶的原理，叶绿素等色素分子溶于有机溶剂而不 溶于有
12、极性的水。故在研磨和收集叶绿色素时要用丙酮或乙醇等有机溶剂而不用水。 叶绿素分布于基粒的片层薄膜上，加入少许二氧化硅是为了磨碎细胞壁、质膜、叶绿体被膜 和光合片成，使色素溶解于丙酮中。3. 破碎的细胞中含有草酸等有机酸，叶绿素分子中含 有的 Mg 元素处于不稳定化合态，镁离子与有机酸结合将导致色素分子破坏。加入少许碳酸 钙使得钙离子与有机酸结合，减少镁离子的转移，防止研磨时叶绿体色素的破坏。所以在研 磨时加入适量的碳酸钙，同时加入碳酸钠的道理亦如此。 在过滤时选用脱脂棉或纱布，而不用滤纸。原因主要有下：（1）色素分子比较大，不容易透 过滤纸； （2）滤纸有较强的吸附性而使色素吸附在滤纸上，从而
13、降低色素浓度，影响实验 效果；（3）叶绿素是脂溶性，根据相似相容的原理，脱脂棉可以减少实验过程中色素的流失， 增强实验效果。根据物理学中的毛细现象，画滤纸细线前滤纸必须经过干燥处理，是为了阻 止水分子堵塞滤纸中的毛细管而影响层析液的扩散。但如果用火烤的话，会使滤纸纤维变形 同时破坏啦毛细管，而影响层析液的扩散。 沿滤纸边缘扩散过快，而导致色素带分离不整齐的现象。故而，在插入层析液的滤纸条一端 剪去两个角。沿滤纸条向上的“壁流”而导致色素溶解。 色素分离的原理：纸层析是用滤纸作为载体的一种色层分析法，其原理主要是利用混合物中 各组分在；流动相和固定相的分配比（溶解度）的不同而使之分离。滤纸上吸附
14、的水为固定 相（滤纸纤维常能吸20%左右的水），有机溶剂如乙醇等为流动相，色素提取液为层析试样。 把试样点在滤纸的滤液细线位置上，当流动相溶剂在滤纸的毛细管的作用下，连续不断地沿 着滤纸前进通过滤液细线时，试样中各组份便随着流动相溶剂向前移动，并在流动相和固定 相溶剂之间连续一次有一次的分配。结果分配比比较大的物质移动速度较快，移动距离较远； 分配比较小的物质移动较慢，移动距离较近，试样中各组分分别聚集在滤纸的不同的位置上， 从而达到分离的目的。 物理：叶绿素是植物进行光合作用的主要色素,是一类含脂的色素家族 叶绿素 ,位于类囊体膜.叶绿素吸收大部分的红光和紫光但反射绿光,所以叶绿素呈现绿色,
15、它在光合 作用的光吸收中起核心作用.叶绿素为镁卟啉化合物,包括叶绿素 a、b、c、d、f 以及原叶绿 素和细菌叶绿素等.叶绿素不很稳定,光、酸、碱、氧、氧化剂等都会使其分解.酸性条件下, 叶绿素分子很容易失去卟啉环中的镁成为去镁叶绿素.叶绿素有造血、提供维生素、解毒、 抗病等多种用途。化学性质：高等植物叶绿体中的叶绿素主要有叶绿素a和叶绿素b两种.它们不溶于水，而溶 于有机溶剂，如乙醇、丙酮、乙醚、氯仿等.叶绿素a分子式：C55H72O5N4Mg；叶绿素 叶 绿素荧光仪。b分子式：C55H70O6N4Mg.在颜色上,叶绿素a呈蓝绿色，而叶绿素b呈黄绿色.按化学性质 来说,叶绿素是叶绿酸的酯,能
16、发生皂化反应.叶绿酸是双羧酸,其中一个羧基被甲醇所酯化,另 一个被叶醇所酯化。高等植物叶绿体中的叶绿素主要有叶绿素a和叶绿素b两种。它们不溶于水，而溶于有机 溶剂，如乙醇、丙酮、乙醚、氯仿等。叶绿素a分子式：C55H72O5N4Mg；叶绿素 叶 绿素荧光仪b分子式：C55H70O6N4Mg。在颜色上，叶绿素a呈蓝绿色，而叶绿素b呈黄绿色。按化 学性质来说，叶绿素是叶绿酸的酯，能发生皂化反应。叶绿酸是双羧酸，其中一个羧基被甲 醇所酯化，另一个被叶醇所酯化。叶绿素分子含有一个卟啉环的“头部”和一个叶绿醇的“尾巴”。镁原子居于卟啉环的中央， 偏向于带正电荷，与其相联的氮原子则偏向于带负电荷，因而卟啉具有极性，是亲水的，可 以与蛋白质结合。叶醇是由四个异戊二烯单位组成的双萜，是一个亲脂的脂肪链，它决定了 叶绿素的脂溶性。叶绿素不参与氢的传递或氢的氧化还原，而仅以电子传递（即电子得失引 起的氧化还原）及共轭
