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1、第九章 核酸类药物制备原理第一节 概 述一、核酸的概念及重要性核酸是生物体的一种大分子化合物，由于最初从细胞核分离出来，又具有酸 性，故得名为核酸，但是核酸不仅存在于细胞核内，而且也存在于细胞质中。在 自然界中，人、动物、植物和微生物都含有核酸，即使比细菌还小的病毒也同样 含有核酸。所以凡是有生命的地方就有核酸的存在。目前，核酸的生物功能已成为引入注意的中心问题之一。大量事实证明，核 酸是生物遗传的物质基础。对生物的生长、发育、繁殖、遗传和变异有密切的关 系，它又是蛋白质生物合成不可缺少的物质。例如有人从鲫鱼肝脏和睾丸提取核 酸并将这些核酸分别注入刚受精的金鱼卵。结果此金鱼卵孵化而成的金鱼有一
2、部 分失去了金鱼的双尾鳍特征，而变成鲫鱼样的单尾鳍。核酸的化学组成研究，已 从分子水平说明核酸能够储存、复制和传递遗传信息。我们日常所见的“种瓜得 瓜，种豆得豆”，等遗传现象就是遗传物质将它储存的生物遗传信息传递给子代 的结果。五十年代以后，人们陆续发现了几类功能不同的核酸，他们是蛋白质合成不 可缺少的成分。凡是生长或分化旺盛的组织（如胚胎细胞、肿瘤、增殖迅速的细 胞等）及分泌活跃的细胞（如胰腺的外分泌细胞、胃粘膜的胃蛋白酶分泌细胞等）， 其蛋白质合成都很旺盛。此时，在它们的细胞质和核仁中必然含有大量的核酸。这就说明核酸与蛋白 质合成有着密切的关系。随着核酸理论方面研究的迅速发展，它在各方面的
3、应用也日益得到重视，在 医药方面的应用更是如此。病毒的致病作用就是由于其核酸侵入机体细胞所致。 恶性肿瘤、放射病及遗传性疾病都与核酸生物功能的改变有关。因此影响核酸代 谢的药物在抗病毒和抗肿瘤中已得到日益广泛的应用。在抗癌药物中，许多是属于核酸类衍生物。如治疗消化道癌症的5-氟尿嘧啶， 治疗白血病的胞嘧啶阿拉伯糖苷（阿胞苷）和 6-巯基嘌呤等。病毒主要是由蛋白质和核酸组成的，对于病毒引起的疾病如天花、狂犬病、 乙型脑炎等虽然有些已经可以用免疫方法予以防治，但治疗用的药物很少。最近 的研究表明，应用核酸类衍生物作为抗病毒药物已呈现出令人鼓舞的效果。例如， 病毒性眼角膜炎，其他许多药物疗效均不甚好
4、，而一些核苷衍生物，如 5-碘脱氧 尿嘧啶核苷（碘苷），胞嘧啶阿拉伯糖苷（阿胞苷）等却可治愈此病。其次，在研究 病毒性疾病时发现，人体感染病毒后能刺激机体产生一种蛋白质，对侵入的病毒 繁殖有干扰作用，因而保护未受感染细胞免受感染，这种蛋白质称为“干扰素”。 但它很不稳定，且有种属特异性，因而作为药物还不现实。现在已发现给人体注 射一种干扰素诱导物，能使体内产生干扰素而达到防治病毒的目的。用人工方法 合成的多种双股多聚核苷酸，如多聚肌苷酸、多聚胞苷酸，就具有防治病毒性疾 病的疗效。各种抗癌和抗病毒药物之所以有抗癌抗病毒作用，是因为癌变细胞和病毒中 核酸和蛋白质的合成比较旺盛，而这类药物可以抑制病
5、原核酸和蛋白质的合成， 从而抑制了癌细胞和病毒的进一步增殖。所以抗癌和抗病毒药物的作用机制是与 核酸密切联系的。二、核酸的分子结构如同蛋白质是由许多氨基酸基本单位组成的情况一样，核酸是由许多基本单 位连结而成的。组成核酸的基本单位是单核苷酸。单核昔酸是由一分子嘧啶或嘌 吟类化合物（即碱基），一分子戊糖（核糖或脱氧核糖）和一分子磷酸组成的。单核 苷酸分子中嘧啶和嘌岭类化合物与核糖或脱氧核糖连结的部分称为核苷。核苷的 戊糖部分再与磷酸结合就构成单核苷酸。在单核苷酸的分子中，嘧啶碱以N与戊糖的C连接，嘌吟碱以N9与戊糖 q连接，磷酸接在戊糖的C5上。它们可用通式表示如下：碱墓1戊糖磷酸：1 单核苷酸
6、根据它们分子中的碱基和戊糖的不同而命名，所以组成核糖核酸 （RNA）的单核苷酸有如下四种：即腺苷酸、鸟苷酸、胞苷酸和尿苷酸。同样，组 成脱氧核糖核酸（DNA ）的单核苷酸也有四种：即脱氧腺苷酸、脱氧鸟苷酸、脱氧 胞苷酸和脱氧胸苷酸。因为单核苷酸分子中的戊糖有几个羟基可与磷酸结合，故单核苷酸又可以根 据磷酸与戊糖结合的位置而有所不同。如腺苷酸就可能有2,-腺苷酸（磷酸接在 2碳原子羟基上，余类推），3,-腺苷酸和5 -腺苷酸。三、核酸的一般性质无论是RNA还是DNA都是分子量很大的复杂有机化合物，都含有C、H、 O、N 和 P 五种元素。RNA 含 N 1516%, P 8.5-9%； DNA
7、含 N 15.2%, P 9.2% 左右。由于核酸含有带共轭双键的嘌吟碱和嘧啶碱，它们都有特殊的紫外吸收光 谱。吸收高峰在260nm左右。核酸溶液的粘滞性比较大，特别是DNA这是因为 DNA分子的高度不对称性引起的。粘滞性减低或消失就表示它已经变性或降解了。核酸一方面带有磷酸基，一 方面又含有嘌吟碱与嘧啶碱，所以也是两性化合物,但由于酸性较强，所以能和 金属离子成盐，也能与一些碱性化合物形成复合物。例如它能与链霉素结合而从 溶液中沉淀出来。第二节核昔酸的生产工艺流程核苷酸是多种核苷类药物的原料，这些药物通常是生物自身能够合成的组成 遗传物质的结构类似物。目前之用于临床的此类药物有几十种，并且正
8、在深入研 究开发。为了研究核酸，通常必须将它们与其他细胞成分分离，并将其纯化。由于它 具有酸性（每个核苷酸残基带一个负电荷）所以在细胞中常与碱性蛋白（鱼精蛋白、 组蛋白）和金属阳离子（碱金属或碱土金属）结合。如果将这些碱性结合物全部除 去，核酸将发生不可逆的变性。因此，在提取核酸时通常用含盐的pH7的缓冲 液。另一方面，因为DNA是又长又细的线状分子（直径20A，长度为几微米到几 毫米），所以很脆弱，振摇、机械力和酶很容易使其降解。为此，如果我们需要 分离完整的天然DNA，则必须十分小心，以防降解。一般应采取低温（0C左右）, 避免在提取过程中用强酸或强碱，并加用抑制剂（如制备DNA时用柠檬酸
9、、氟化 物、砷酸盐或EDTA等）以抑制酶的破坏作用。提取核酸的一般原则是用机械方法或酶学方法(溶菌酶)使细胞破碎，然后用 蛋白质变性剂如苯酚、去垢剂(硫酸十二酯钠等)处理，使蛋自质沉淀。这种提取 和去蛋白的过程要重复几次。最后，所获得的核酸溶液用乙醇使其沉淀。值得注意的是，在细胞中核酸有二大类，即DNA和RNA, RNA又包括 m-RNA， r-RNA， t-RNA 等，这就使得对它们的提取和纯化过程变得更加复杂， 因此没有一种通用的方法可适用于所有核酸的分离，不同的核酸应该使用不同的 方法进行分离。一、DNA的制备DNA蛋白在不同浓度的NaCl溶液中溶解度十分不同，它在水中可以溶解, 当Na
10、C 1浓度为0.14M时，溶解度最低，仅为水中溶解度的1/100。当NaC 1浓度 再增加时，溶解度又增加，例如在0.5M时溶解度与水相似，而当NaCl增至1M 时，DNA蛋白溶解度较在水中大二倍以上。这种溶解度变化可被用以提取DNA， 也可以使DNA蛋白和RNA蛋白分离，因为RNA蛋白在0.14M的NaC 1溶液中 能够溶解，而DNA蛋白则不溶解，借此可以分离。从DNA蛋白提取液中去掉蛋白质的方法很多，常用者有：(1)三氯甲烷法。 将DNA蛋白溶液和等体积的三氯甲烷一戊醇(3： 1)混合物激烈振荡、离心，上 层水液含DNA、蛋白，下层为三氯甲烷和戊醇，两层之间为蛋白凝胶。上层水 液再用三氯甲
11、烷戊醇的混合液处理如上，并反复数次，至二层之间无蛋白胶状 物为止。(2)去污剂法。是目前最常用的方法，因为这种方法可以获得一种很少 降解，而又可以复制的DNA制品。并且它还有一个优点，既阴离子型去污剂既 能解离核蛋白络合物，使它分离成为核酸与蛋白质，同时又能使蛋白质沉淀。二、RNA的提取RNA比DNA对酸、碱的作用更不稳定，因此在提取RNA及其核蛋白的方 法中都必须采用温和试剂。RNA与DNA不同，RNA蛋白能溶于0.14MNaC1溶 液中，因此可用此溶液提取。从提取液中去除蛋白的方法有：(1)在 10%NaC1中加热至90C，离心除去 不溶物，加乙醇使RNA沉淀，或调等电点沉淀RNA。(2)
12、用胍盐酸盐(最终浓度 2M)可溶解大部分蛋白质，冷却，RNA即沉淀而出。粗制品再用三氯甲烷法除去 少量残余蛋白质。(3)去污剂法。最常用的为硫酸十二酯钠，用此法可从酵母制 得大分子RNA。(4)苯酚法。可用90%苯酚提取，离心后，蛋白质和DNA留在酚层，而RNA在上层水液内，然后进一步分离。三RNA的化学水解法制备核昔的工艺流程图9-1核昔生产工艺流程圏第三节核酸类药物制备工艺核酸类药物可分为两大类。一类为具有天然结构的核酸类物质,这些品种都 是生命体合成的原料，或是蛋白质、脂肪、糖生物合成，降解以及能量代谢的辅 酶。属于这类的核酸类药物有肌苷、ATP、辅酶A、脱氧核苷酸、肌苷酸、鸟三磷、胞三
13、磷、尿三磷、腺嘌吟腺苷、5Z -核苷酸混合物、丫，3-核苷酸混合 物、辅酶I、辅酶II等。这些药物多数是生物体内自身能够合成的物质，在具有 一定临床功能的前提下，毒副作用小。它们的生产基本上都可以经微生物发酵或 从生物资源中提取。另一类为自然结构碱基、核苷、核苷酸结构的类似物或聚合 物，这一类核酸类药物是当今人类治疗病毒、肿瘤、艾滋病的重要手段，也是产 生干扰素，免疫抑制的临床药物。已经正式在临床应用的有阿糖胞苷、聚肌胞苷 酸、无环鸟苷、阿糖腺苷等。一、阿糖胞昔(Cytarabine)的制备(一) 结构与性质化学名称为 1- B -D-咲喃阿糖胞嘧啶(1- B -D-Arabinofurano
14、sylcytosine)阿糖胞苷又称胞嘧啶阿拉伯糖苷，与正常的胞嘧啶核苷及脱氧胞嘧啶核苷不 同，其差别在于糖的组成部分是阿拉伯糖，不是核糖或脱氧核糖。白色或类白色 结晶性粉末，无臭，易溶于水，略溶于甲醇、乙醇中，乙醚中极微溶。阿糖胞苷熔点212213.5C，其盐酸盐熔点为186190C(分解)。在酸及中性水溶液中脱氨水解变成阿糖脲苷，pH 2.8时 水解速度最大，pH6.9时相对较小，pH10以上水解速度急 剧加快，故最稳定的pH为6.9。在碱性溶液中，其损失大 约比在酸中快10倍。临床应用的是阿糖胞苷盐酸盐，商品名称Cytarabine、 Cytodar，进入体内转变为阿糖胞苷酸，抑制DNA
15、聚合酶， 阻止胞二磷转变为脱氧胞二磷，从而抑制DNA的合成， 干扰DNA病毒繁殖和肿瘤细胞增殖。用于治疗急性粒细 胞白血病，具有见效快，选择性高的特点，单独使用不如 与其它抗癌药合用疗效高，口服无效，只能注射。(二) 生产工艺1以5 -CMP为原料的合成法阿糖胞昔(1)工艺路线2。七丿HOPOCHi NOHO水解NH4UH.lxyH)j FH8-9T90 t.FhL氧桥化POCb瘫辔本，酷確乙龍 (H：g 8OX,0&f4O-5OmmNH25 -CMPNH2(2)工艺过程 水解称取5 -CMP(纯度30%)100g,悬浮于800ml蒸馏水中，加入浓氨水约50ml, 调节pH89,使5-CMP全
16、部溶解(如5Z -CMP粗品质量较差，加碱后有不溶物, 可过滤或离心除去)，稀释至1L，倒入10L的三口圆底烧瓶中，并加入处理好的 6.5L氢氧化镧凝胶，总体积为7.5L,升温至90C，在不断搅拌下，于pH9下进 行水解。在不同的反应时间内，均匀取出2ml凝胶溶液，离心分离，取上清液5 至1 口 L, pH9.2电泳分析，检查水解程度。当反应25h后，电泳纸上5 -CMP 位置紫外点消失，仅有胞嘧啶核苷(CR)的紫外点位置，为水解终点。然后进行离 心分离(2500r/min),得上清液，凝胶沉淀用蒸馏水洗2次，每次用水为3L左右， 再离心(25003000r/min)10min,得洗涤液，与上清液合并。再减压浓缩至0.4L 左右，呈混浊，过滤除去不溶物，可
