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1、动物肝脏中dnA勺提取及检测一、前言脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸（DNA为英文Deoxyribonucleicacid的缩写），又称去氧核糖核酸，是脱氧核糖核酸染色体的主要化学成分，同时也是组成基因的材料。有时也被称为“遗传微粒”，原因是在繁殖过程中，父代会把它们自己DNA勺一部分复制传递到子代中，从而完成性状的传播。DN渥高分子聚合物，DNA容液为高分子溶液，具有很高的粘度，可被甲基绿染成绿色。DNA寸紫外线（260nm有吸收作用，利用这一特性，可以对DNAS行含量测定。当核酸变性时，吸光度升高，称为增色效应；当变性核酸重新复性时，吸光度又会恢复到原来的水平。较高温度、有机溶剂、酸碱试剂、尿素、
2、酰胺等都可以引起DN砌子变性，即DN破链碱基间的氢键断裂，双螺旋结构解开一也称为DNA的解螺旋。在细胞内，DNAft与蛋白质结合形成染色体，整组染色体则统称为染色体组。对于人类而言，正常的体细中含有46条染色体。染色体在细胞分裂之前会先在分裂间期完成复制，细胞分裂间期又可划分为：G1期-DNA合成前期、S期-DNA合成期、G2-DN给成后期。对于真核生物，如动物、植物及真菌而言，染色体主要存在于细胞核内；而对于原核生物，如细菌而言，则主要存在于细胞质中的拟核内。染色体上的染色质蛋白，如组织蛋白，能够将DNAS行组织并压缩，以帮助DNAW其他蛋白质进行交互作用，进而调节基因的转录。脱氧核糖核酸的
3、结构DNA勺结构：DNA的结构一般可划分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构四个水平。DN渥一种长链聚合物，组成单位为四种脱氧核甘酸，即腺喋吟脱氧核甘酸（dAMP脱氧腺甘）、胸腺喀咤脱氧核甘酸（dTMP脱氧胸甘）、胞喀咤脱氧核甘酸（dCMP脱氧胞甘）、鸟喋吟脱氧核甘酸（dGMP脱氧鸟昔）。而脱氧核糖（五碳糖）与磷酸分子借由酯键相连，组成其长链骨架，排列在外侧，四种碱基排列在内侧。每个糖分子都与四种碱基里的其中一种相连，这些碱基沿着DN张链所排列而成的序列，可组成遗传密码，指导蛋白质的合成。读取密码的过程称为转录，是以DNAX链中的一条单链为模板转录出一段称为mRNA信使RNA的核酸分子。D
4、N渥由许多脱氧核甘酸按一定碱基顺序彼此用3,5-磷酸二酯键相连构成的长链。大多数DN给有两条这样的长链，也有的DN的单链，如大肠杆菌噬菌体0X174G4M13等。DNAf环形DNA和链状DNQ分。在某些类型的DN衅，5-甲基胞喀咤可在一定限度内取代胞喀咤，其中小麦胚DNA勺5-甲基胞喀咤特别丰富。在某些噬菌体中，5-羟甲基胞喀咤取代了胞喀咤。40年代后期，查加夫（E.Chargaff）发现不同物种DNA勺碱基组成不同，但其中的腺喋吟数等于其胸腺喀咤数（A=D,鸟喋吟数等于胞喀咤数（G=C,因而喋吟数之和等于喀咤数之和，一般用几个层次描绘DNA勺结构。浓盐法从动物组织中提取DNA核酸和蛋白质在生
5、物体中常以核蛋白（DNP/RNP的形式存在，其中DNRIB溶于水及高浓度盐溶液，但在0.14M的盐溶液中溶解度很低，而RNPM可溶于低盐溶液，因此可利用不同浓度的NaCl溶液将其从样品中分别抽提出来。将抽提得到的DN即SD的理可将其分离DN府口蛋白质，用氯仿-异戊醇将蛋白质沉淀除去可得DNA清，加入冷乙醇即可将其呈纤维状析出。肝脏细胞肝脏是由肝细胞组成，肝细胞极小，肉眼看不到，必须通过显微镜才能看到。人肝约有25亿个肝细胞，5000个肝细胞组成一个肝小叶，因此人肝的肝小叶总数约有50万个。肝细胞为多角形，直径约为20-30/力（微米），有6-8个面，不同的生理条件下大小有差异，如饥饿时肝细胞体
6、积变大。每个肝细胞表面可分为窦状隙面、肝细胞面和胆小管面三种。肝细胞里面含有许许多多复杂的细微结构：如肝细胞核、肝细胞质、线粒体、内质网、溶酶体、高尔基氏体、微粒体及饮液泡等组成。二、实验目的1.掌握浓盐法从动物组织中提取DNA勺原理与技术三、实验原理核酸和蛋白质在生物体中常以核蛋白（DNP/RNP的形式存在，其中DNRlg溶于水及高浓度盐溶液，但在0.14M的盐溶液中溶解度很低，而RNPM可溶于低盐溶液，因此可利用不同浓度的NaCl溶液将其从样品中分别抽提出来。将抽提得到的DN两SDSt理可将其分离DN解口蛋白质，用氯仿-异戊醇将蛋白质沉淀除去可得DNA上清，加入冷乙醇即可将其呈纤维状析出。
7、四、实验器材和材料试剂实验器材：匀浆器量筒离心机离心管试管吸管恒温水浴锅实验材料：猪肝实验试剂：0.1mol/LNaCl-0.05mol/L柠檬酸钠溶液（pH6.8）95%OI（A.R.）NaCl固体（A.R.）5%SD蟒液（5gSDS定容至100ml）V（氯仿）：V（异戊醇）20:1的混合液五、实验操作1 .称量称取一定质量的猪肝，加入2倍肝重的0.1mol/LNaCl-0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液并用匀浆器磨碎（已完成）。2 .提取DNA量取肝糜4ml于10毫升离心管，在4000r/min下离心10min,沉淀中再加入8ml缓冲液于4000r/min离心5min;弃上清，取沉淀；将沉淀
8、用10ml柠檬酸钠缓冲液完全洗入干净的小烧杯、加入5ml氯仿-异戊醇混合液、1mlSDS,振荡30min（保鲜膜封口）；缓慢加入固体NaCl（约0.9g）,使其最终浓度为1mol/L;将溶液分装到2个10毫升离心管中，在4000r/min离心5min,取上清水相；在上述水相溶液中分别加等体积冷95%L醇，边加边用玻棒慢慢朝一个方向搅动，将缠绕在玻棒上的凝胶状物用滤纸吸去多余的乙醇，即得DNAlfi品；用8ml蒸储水溶解DNAfi品于10ml离心管中。一水柏（含DNA衲it；黄白凝股层有机相3 .标准曲线的绘制按下表加入各种试剂，混匀，于60c恒温水浴锅45min,冷却后，在595nm波长下于分
9、光光度计比色测定，以吸光度对DN雁度作图，制作标准曲线。012345标准DNA容液/ml0.00.40.81.21.62.0蒸储水/ml2.01.61.20.80.40二苯胺试剂/ml4.04.04.04.04.04.0A595nm4.样品的测定将DN腐A品定容至25ml容量瓶，再取DNA羊?夜1.0ml,加入蒸储水1.0ml,混匀。然后准确加入二苯胺试剂4.0ml,混匀，于60C恒温水浴锅45min,冷却后，595nm波长下于分光光度计比色测定，根据所测的吸光度对照标准曲线求得DNA勺质量（ug）5.计算100g猪肝中DN总量w=m1/m2100%w:DNA勺质量分数（ml:样液中测得的DN
10、A勺质量（ug）m2样液中所含1品的质量（ug）六、实验数据处理1.标准曲线012345标准dnAK/ml0.00.40.81.21.62.0蒸储水/ml2.01.61.20.80.40二苯胺试剂/ml4.04.04.04.04.04.0A595nm00.0390.090.1460.1970.249DN总量/ug08016024032040045000.050.10.150.2025032.实验结果处理猪肝质量为2.04gDNAI取液体积为12.53ml序号123A595nm0.1020.1020.101平土AA595nm0.102样液中DN给量/ug171.4样液中样品质量/g0.1628根
11、据公式w=m1/m2100%得：w=0.1053%则100g猪肝中DN给量为：wx100=0.1053g七、思考题1 .实验中的乙醇、SDS氯仿-异戊醇、NaCl、柠檬酸钠分别有什么作用？答：柠檬酸的钠盐在实验中既充当DNA酶的抑制剂，也是pH缓冲溶液；SDSM表面活性剂，可以让蛋白质与DN砌开；氯仿是有机溶剂，可以使蛋白质聚集沉淀，便于分离出去；异戊醇是消泡剂，可以减少泡沫的发生；氯仿-异戊醇的作用是使蛋白质变性、膜溶解；NaCl固体溶解使得试液成为高浓度的盐溶液，在这样的环境中DN砥蛋白能溶解，RN能蛋白则溶解度很低，可以利用这一性质分离两种核酸。八、实验注意事项1 .DNA主要集中在细胞
12、核中，因此，通常选用细胞核含量比例大的生活组织作为提取制备DNA勺材料，小牛胸腺组织中细胞核比例较大，因而DN总量丰富，同时其脱氧核甘酸酶活性较低，制备过程中DN蹴降解的可能性相对较低，所以是制备DNA勺良好材料，但其来源较困难，脾脏或肝脏易获得，也是实验室制备DNAa用的材料，本实验用新鲜肝脏作为实验材料。2 .为了防止大分子核酸在提取过程中被降解，须采取以下措施：整个过程必须在低温下进行，可加入某些物质抑制核酸酶的活性，如柠檬酸钠、EDTASD湃，EDTA是抑制核酸酶的活性最好的抑制剂。3 .从核蛋白中脱去蛋白质的方法很多，经常采用的有：氯仿-异丙醇法、苯酚法、去垢剂法等，他们均能使蛋白质
13、变性和核蛋白解聚，并释放出核酸。4 .使用离心机时，对称放置的离心管必须用天平调平衡。5 .避免剧烈振荡，如研磨过程、搅拌过程等。九、实验结果误差分析及讨论经过对本次实验结果进行分析，得出100g猪肝中DNA含量大约为0.1053g的结论，在上网查阅相关资料后发现：猪肝中DN蛤量与本次试验实际操作测量得出的结果大致相互吻合。由此可知，本次试验结果是相对比较成功的，较为粗略地测量出猪肝中DNA勺含量，并且较为熟练地掌握了浓盐法从动物组织中提取DNA勺原理与技术，基本达到了本次实验的目的。但是本次实验结果只是粗略测量，并未达到精确测量猪肝中DNA的含量，且实验数据较理论值偏低，这是由于某些误差导致
14、，在实验过程中些许因素可能会导致实验结果数据有偏差，经分析得出以下几点：在称取猪肝后加入柠檬酸钠缓冲液进行研磨的过程中，由于猪肝组织表面较滑不易磨碎，且研磨至最后依旧有小部分猪肝组织块残留，因此可能导致猪肝中DNAI取不充分，致使实验数据较理论值偏低；研磨过程中，可能由于操作不当，导致部分液体溅出，因此可能使得提取液中部分DN硼失，导致实验数据偏低;在粗提取DN姆作中，频繁地将DNAI取液转移至各个仪器内,可能有极小部分DNAI取液未倒净，残留在仪器壁上损耗掉，导致实验误差；在使用移液枪的过程中，可能因为操作不当或移液枪经常错误使用，出现仪器误差，导致吸取的DNA羊液不精确，出现实验误差；在水相中加入乙醇析出DNA寸，不是所有DNA匀析出，有小部分依旧融在溶液，导致提取出的DN给量偏低；标准曲线制作过程中出现些许误差；总的来讲，本次试验结果是相对比较成功的，较为粗略地测量出猪肝中DNA勺含量，并且较为熟练地掌握了浓盐法从动物组织中提取DNA勺原理与技术，基本达到了本次实验的目的。在今后的实验中会着重注意实验操作的严谨性，严格按照实验前拟定完全的实验步骤进行，保证将实验操作过程中可能出现的误差概率降到最低，尽可能达到预期的实验效果，完成自我的学习及锻炼过程。
