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1、半微量凯氏定氮法测定蛋白质含量(一) 方法原理样品与硫酸一同加热消化，分解有机质，释放出的NH3与硫酸结合成硫酸铵留在溶液中。 在定氮消化瓶中，用氢氧化钠中和硫酸铵生成氢氧化铵，加热又分解NH3 ,用硼酸吸收，用标 定过的盐酸或硫酸滴定，从而计算出总氮量，换算为蛋白质量。(二) 仪器、设备1. 仪器分析天平：感量0.0001克；实验用粉碎机；半微量凯氏蒸馏装置；半微量滴定管，容 积10毫升；硬质凯氏烧瓶：容积25毫升，50毫升；锥形瓶：容积150毫升；电炉：600 瓦。2. 试剂(1) 盐酸：分析纯，0.02mol/L, 0.05mol/L标准溶液(邻苯二甲酸氢钾法标定)；(2) 氢氧化钠：工
2、业用或化学纯，40%溶液(W/V)；(3) 硼酸：分析纯，2%溶液(W/V)；(4) 硼酸混合指示剂：漠甲酚绿0.1克，甲基红0.1克分别溶于95%乙醇中，混合后稀 至100毫升，将混合指示剂与2%硼酸溶液按1:100比例混合，用稀酸或稀碱调节PH值为 4.5,使呈灰紫色，此溶液放置时间不宜过长，需在1个月之内使用；(5) 加速剂：五水合硫酸铜(分析纯)10克，硫酸钾(分析纯)100克在研钵中研磨，仔 细混匀，过40目筛；(6) 浓硫酸：比重1.84,无氮；双氧水：分析纯,30%；蔗糖：分析纯；(7) 双氧水硫酸混合液(简称混液)：双氧水、硫酸、水的比例为3:2:1,即在100毫升 蒸馏水中，
3、慢慢加入200毫升浓硫酸，待冷却后，将其加入300毫升30%双氧水，混匀，此 混液可一次配制5001000毫升贮藏于试剂瓶中备用，夏天最好放入冰箱或阴凉处贮藏， 室温(20C)上下时不必冷藏，贮藏进间不超过1个月。(三) 操作步骤1. 样品的选取和制备选取有代表性的种子(带壳种子需脱壳)挑拣干净，按四分法缩 减取样，取样量不得少于20克。将种子放于6065C烘箱中干燥8小时以上，用粉碎机磨 碎，95%通过40目筛，装入磨口瓶备用。2. 称样称取0.1克试样两份(含氮17毫克)，精确至0.0001克，同时测定试样的水 分含量。3. 消煮1将试样置开25毫升凯氏瓶中，加入加速剂粉末。除水稻为1克外
4、，其它均 为2克。然后加3毫升硫酸，轻轻摇动凯氏瓶，使试样被硫酸湿润，将凯氏瓶倾斜置于电炉 上加热，开始小火，待泡沫停止后加大火力，保持凯氏瓶中的液体连续沸腾，沸酸在瓶颈 中部冷凝回流。待溶液消煮到无微小的碳粒并呈透明的蓝绿色时 谷类继续消煮30分钟， 豆类继续消煮60分钟。4. 消煮2将试样置于50毫升凯氏瓶中，加入0.5克加速剂和3毫升混液，在凯氏瓶上 放一曲颈小漏斗，倾斜在电炉上加热，开始小火（用调压器将电压控制在175伏左右），保 持凯氏瓶中液体呈微沸状态。5分钟后加大火力（将电压控制在200伏左右）。保持凯氏瓶中 液体连续沸腾，消煮总时间，水稻、高粱为30分钟，其它均为45分钟。注：
5、消煮中列入两种消煮条件，经与国际谷物化学协会标准法（ICC）比较，t值测验均不显 著，准确度与精密度也基本一致,在具体工作中可根据实际情况取其一种。5. 蒸馏消煮液稍冷却后加少量蒸馏水，轻轻摇匀。移入半微量蒸馏装置的反应室中， 用适量蒸馏水冲洗凯氏瓶45次。蒸馏时将冷凝管末端插到盛有10毫升硼酸指示剂混合液 的锥形瓶中，向反应室中加入40%氢氧化钠溶液15毫升（如采用消煮2的条件，加10毫升 即可）。然后通气蒸馏，当馏出液体积约达50毫升时，降下锥形瓶。使冷凝管末端离开液面, 继续蒸馏12分钟，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均需流入锥形瓶中。6. 滴定 谷类以0.02mol/L，豆类以0.05m
6、ol/L标准盐酸或硫酸滴定至锥形瓶中的溶液 由蓝绿色变成灰紫色为终点。空白用0.1克蔗糖代替样品作空白测定。消耗标准酸溶液的体 积不得超过0.3毫升。（四）结果计算式中：V2滴定试样时消耗标准酸的体积（毫升）V1滴定空白时消耗标准酸的体积（毫升）N标准酸溶液的浓度（mol/L）K氮换算成粗蛋白质的系数W试样重量（克）X试样水分含量0.0140每毫摩尔氮的克数平行测定的结果用算术平均值表示，保留小数后二位。两份试样粗蛋白质的平行测定结果为15%以下时，其相对相差不得大于3%； 15%30%进为 2%； 30%以上为1%。结果必须注明氮换算成粗蛋白质的系数，换算系数见表（2-1）。表不同作物种子含氮量换算成粗蛋白之系数K 种子换算系数麦类、豆类5.70水稻5.95高梁5.83大豆6.25其它谷物6.25
