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1、编号：2-2主题：第二代DNA测序技术概述：第一代测序(缺点：通量低 1000个核苷酸/反应，费用高 化学降解法 双脱氧链终止法(Sanger法) 荧光自动测序技术 杂交测序技术高通量测序：第二代测序(next-generation sequencing，NGS)第二代测序技术的核心思想是边合成边测序(Sequencing by Synthesis)，即通 过捕捉新合成的末端的标记来确定 DNA 的序列，现有的技术平台主要包括Roche/454 FLX 、 Illumina/Solexa Genome Analyzer 和 Applied Biosystems SOLID system 。这三
2、个技术平台各有优点， 454 FLX 的测序片段比 较长，高质量的读长(read)能达到400bp; Solexa测序性价比最高，不仅机 器的售价比其他两种低，而且运行成本也低，在数据量相同的情况下，成本只 有 454 测序的 1/10; SOLID 测序的准确度高，原始碱基数据的准确度大于 99.94%,而在15X覆盖率时的准确度可以达到99.999%，是目前第二代测序技 术中准确度最高的。虽然第二代测序技术的工作一般都由专业的商业公司来完 成，但是了解测序原理、操作流程等会对后续的数据分析有很重要的作用，下 文将以 Illumina/Solexa Genome Analyzer 测序为例，
3、简述第二代测序技术 的基本原理、操作流程等方面。原理：Illumina/Solexa Genome Analyzer 测序的基本原理是边合成边测序。在 Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不 同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同 的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测 DNA的序列信息。Illumi na Solexa测序仪特点:桥式PCR 边合成边测序 可逆终止物Illumina Solexa 测序流程:操作步骤:1) 测序文库的构建(Library Construction)首先准备基因组D
4、NA(虽然测序公司要求样品量要达到200ng,但是Gnome Analyzer系统所需的样品量可低至100ng，能应用在很多样品有限的实验中), 然后将DNA随机片段化成几百碱基或更短的小片段，并在两头加上特定的接 头(Adaptor)。如果是转录组测序，则文库的构建要相对麻烦些，RNA片段化 之后需反转成cDNA，然后加上接头，或者先将RNA反转成cDNA,然后再 片段化并加上接头。片段的大小(Insert size)对于后面的数据分析有影响，可根 据需要来选择。对于基因组测序来说，通常会选择几种不同的insert size，以 便在组装(Assembly)的时候获得更多的信息。2) 锚定桥
5、接(Surface A卄 achment and Bridge Amplification)Solexa测序的反应在叫做flow cell的玻璃管中进行，flow cell又被细分成8 个Lane，每个Lane的内表面有无数的被固定的单链接头。上述步骤得到的带 接头的DNA片段变性成单链后与测序通道上的接头引物结合形成桥状结构， 以供后续的预扩增使用。3) 预扩增(Denaturation and Complete Amplification)添加未标记的dNTP和普通Taq酶进行固相桥式PCR扩增，单链桥型待测片 段被扩增成为双链桥型片段。通过变性，释放出互补的单链，锚定到附近的固 相表面。
6、通过不断循环，将会在Flow cell的固相表面上获得上百万条成簇分 布的双链待测片段。4) 单碱基延伸测序(Single Base Extension and Sequencing)在测序的flow cell中加入四种荧光标记的dNTP、DNA聚合酶以及接头引物 进行扩增，在每一个测序簇延伸互补链时，每加入一个被荧光标记的 dNTP 就 能释放出相对应的荧光，测序仪通过捕获荧光信号，并通过计算机软件将光信 号转化为测序峰，从而获得待测片段的序列信息。从荧光信号获取待测片段的 序列信息的过程叫做Base Calling，Illumina公司Base Calling所用的软件是 Illumina
7、s Genome Analyzer Sequencing Control Software and Pipeline Analysis Software。读长会受到多个引起信号衰减的因素所影响，如荧光标记 的不完全切割。随着读长的增加，错误率也会随之上升。5) 数据分析(Data Analyzing)这一步严格来讲不能算作测序操作流程的一部分，但是只有通过这一步，前面 的工作才显得有意义。测序得到的原始数据是长度只有几十个碱基的序列，要 通过生物信息学工具将这些短的序列组装成长的Contigs甚至是整个基因组的 框架，或者把这些序列比对到已有的基因组或者相近物种基因组序列上，并进 一步分析得到有生物学意义的结果。
