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1、生物分析化学作业 姓名： 学号： 培养单位: 超高效液相色谱-质谱联用同时检测婴儿奶粉中的牛-乳白蛋白和-球蛋白含量Analytica Chimica Acta667 (2010) 96102摘要作者开发了一种能够同时检测出牛-乳白蛋白（-La）和-球蛋白(-Lg)含量的可靠超高效液相色谱法。与之前的方法相比，此法在选区监测模式下与质谱联用，分析速度快，检测限低。为了得到目标分析最好的分辨率，此法采用包含0.1%三氟醋酸(TFA)水溶液（A）和0.1%三氟醋酸（TFA）的乙腈（B）的线性梯度移动相和UPLC BEH300 C18色谱柱（150mm2.1mm,1.7m）。精确定量需要使用人体-乳
2、白蛋白作为内标。鉴于其线性度（R20.9991），灵敏度（定量限，0.150.19gmL1），恢复率（94.098.7%），精确度（相对标准差11.1%），可重复性（相对标准差5.7%），此方法普遍有效。研究显示这是一种在生物药品中同步检测主要乳清蛋白的可行方法。目前有效的方法已被成功应用于婴儿奶粉中的蛋白质检测。前言由于其独特的生物化学营养功能性质，乳清蛋白是非常重要的食品蛋白质，已经被用作运动员的膳食补充和用于食品工业添加剂。婴儿奶粉富含乳清蛋白，是非常重要的市场，在过去的二十年里被广泛开发。因为它们的营养和生物活性，包括-白蛋白在内的各种各样的作料已经或是提议作为添加剂加入到婴儿奶粉中，
3、来更好地模拟人乳的成分。乳清蛋白作为婴儿奶粉的主要成分的一个主要问题是，-球蛋白的存在。这种在母乳中存在的蛋白被报道会引起婴儿的过敏反应，从而限制了牛乳用作婴儿牛奶的原材料。然而，一些商业婴儿奶粉通常都含有大量-球蛋白。另一个问题产生自天然形式的乳清蛋白的质量控制。尽管人们已经知道奶制品的营养和功能直接与蛋白质的自然态相关，但是很难控制奶制品中的成分。不同的加工过程会导致不同的蛋白质改动，从而反过来影响原生态乳清蛋白的品质。所以，不同厂家的相同产品的生物活性也不同。因此，为了保证婴儿奶粉的营养价值，发展-La和-Lg定性定量分析的品质控制方法是个十分重要的问题。基于毛细电泳CE，凝胶电泳GE，
4、液相色谱LC和免疫化学方法的各种各样的分析技术被用作乳清蛋白分析。CE只在蛋白质微量分析中有效，分析时间相对较短，但是重现性不好。尽管CE也能同时检测多个样品，但是比较耗时，精确度低，需要离线检测，限制其应用。免疫化学分析具有高灵敏度，但是制备新抗原的抗体是个冗长的过程。乳清蛋白分析最常用的方法是液相色谱与不同方法联系技术。然而，传统的HPLC法通常使用5m颗粒填充的色谱柱，会消耗很多时间分开目标化合物。为了解决这个缺点，当前人么开发了超高液相色谱UHPLC法。将粒径5m（HPLC）降低到1.7m（UHPLC），从而提高了色谱的分辨率和灵敏度。质谱检测的引入大大提高了蛋白质分析技术，因为其特殊
5、的选择性和提供高度结构特异性信息。越来越多的实验方法证明LC-MS是种检测蛋白质的强大工具。尽管此种分析法在纯溶液和基质中的的离子化效率差异会影响其精确度。这个问题可以通过以下两种途径解决：一、采用外部基质校正；二、在样品中加入内标来校正制样和离子化效应所产生的复苏性损失。用LC-MS定量蛋白质可以再核苷酸水平（经过蛋白质消化后的信号核苷酸分析）或蛋白质水平（未经接触的蛋白质分析）。描述了利用同位素标记合成类似物作为IS通过分析胰蛋白酶信号核苷酸进行蛋白质定量的方法。这种方法的优势是：检测限低和同位素标记核苷酸易于获得。缺点是IS的表现也许会和在消化前过程中的未经接触的蛋白质很不相同。这会导致
6、分析和IS的不同损失，并接着影响方法的精确度。蛋白质水平分析直接进行分析，避免了潜在的会产生问题的消化步骤，但是合适的IS得获得是是一个主要问题。理论上，理想的IS是同位素标记的所分析蛋白质的类似物，它在整个样品制备过程中的表现和被分析蛋白质相似。然而获得这样的IS需要复杂的制备过程。替代方法是采用与所分析蛋白质序列相似的物种变体（例如，不同物种的同一蛋白质）作为IS。此方法采用山羊-Lg和麋羚-Lg作为检察奶制品中牛-Lg的IS。采用LC-MS在生物基体中定量分析蛋白质的关键问题是不同婴儿奶粉中的乳清蛋白含量显著不同所产生的灵敏度问题。在以前的研究中，研究者采用完全扫描模式下的质量分析来获得
7、蛋白质的完全电荷分布（CDs）。这种方法可以避免潜在的精确度或重现性问题。但是，灵敏度达不到同时检测不同婴儿奶粉中主要乳清蛋白质的要求。基于这些考虑，作者在实验室中发展了一种可靠的UHPLC-MS联用的方法用来同时检测婴儿奶粉中牛的-乳白蛋白和-球蛋白。这种方法检测时间短、灵敏度良好、扫描模式可靠、IS合适以及结构鉴定选择性合适。作者还展示并评价了可靠性的细节参数，如线性、恢复性、灵敏度、精确度和重现性。文章中还应用此法检测了不同婴儿奶粉中三种乳清蛋白的分布。2、实验部分2.1 化学药品（材料和试剂）乳清蛋白：牛-Lg（纯度90）和-Lg(A和 B 纯度90) 人乳中分离的人-Lg纯化水、 H
8、PLC级乙腈和甲醇、醋酸、甲酸、三氟醋酸（TFA）、其他溶剂为分析纯、高品质PDEF注射过滤器（孔径0.22m，直径13mm）。2.2 仪器超高液相色谱仪 超高液相色谱BEH300 C18色谱柱（150mm2.1mm,1.7m）流动相速率0.25ml/min流动相包含0.1%三氟醋酸(TFA)水溶液（A）和0.1%三氟醋酸（TFA）的乙腈（B），线性梯度洗脱过程如下（所有值都是体积比% v/v）:初始39%B，在2min内从39%线性上升到42%；在2.3 min内从42%线性上升到44%;在0.2min内从44%线性上升到100%;100% B等度洗脱0.5min；在0.5min内色谱柱移动
9、相恢复到初始成分；2.5min内色谱柱恢复到初始（总持续时间：8min）。注入体积1L。质谱仪采用正电模式电喷雾源。离子化器条件如下：管压3.5kv；进样锥电压，45v；源温度，120；脱溶剂气温度，350；锥孔反吹气流，55Lh-1;去溶剂化气流，580 Lh-1。定量分析在800-3200（m/z）全扫描模式下进行。采用Max-ENT进行多电荷离子解卷积。选区监测模式进行定量。选区（m/z）：牛-La，23572367；人-La（IS），23392349; -Lg A，16651675；-Lg B，16561666。2.3 空白基质制备将0.2g婴儿奶粉溶解在包含0.2%聚乙二醇辛基苯基醚
10、的0.3M的氯化钠溶液中。然后，用TFA将其PH调节至4.6，用水将其体积调至10mL。室温下用高速搅拌机混合10min，过滤，得到5mL滤液，在微波实验室工作站中消化。试验参数为：工作功率，250W;时间，10.5min。消化处理后，将溶液通过0.22m过滤器。2.4 标准溶液的制备含有牛-La，-Lg A，-Lg B和人-La（IS）的存储液（1 mg mL1）在水中制备。含有牛-La，-Lg A，-Lg B的混合溶液（100g mL1）在空白基质中制备。所有溶液都在-20被放在黑暗中不超过1个月。工作标准溶液都是由这些存储溶液制备而成，并在使用之前用空白基质逐步快速稀释。2.5 样品制备
11、每个均匀样品(0.2g)都用500L人-La（1 mg mL1）做内标。这些加标样品被溶解在9mL包含有0.2%（w/v）聚乙二醇辛基苯基醚的0.3M氯化钠溶液中。然后，将溶液用TFA调节PH至4.6，接着加水至10mL。室温下混合均匀10min后，用高速离心机离心在2.1104g离心15min后。上层清液采用0.22m的过滤器过滤后，备用。2.6 蛋白质鉴别根据在标准溶液中相应标准的保留时间和质谱（选取监测模式），样品中的三种蛋白质可以清晰鉴别。3、结果与讨论-Lg A，-Lg B是-Lg的两个变体。这两个变体的区别只在64和118位置的连个氨基酸取代，使得它们的质量相差86Da，如图1所示
12、。在以前的研究中，-Lg A和-Lg B无法完全分开，所以经常以总称-Lg表示。在此前的研究中，三种不同长度和粒径的LC色谱柱被用作对比分离效果，例如，（1）Waters Symmetry 300 C18色谱柱（75 mm4.6 mm, 3.5m）(2) Waters Symmetry 300 C18色谱柱 (100 mm2.1 mm, 3.5m) 和(3) Waters Acquity UPLC BEH300 C18 色谱柱 (150 mm2.1 mm, 1.7m)。结果表明，色谱柱3的分离效果明显好于色谱柱1和2。这也许是因为其粒径减小到1.7m的原因，净表面积的增加使得柱效提高。所以作者
13、选择了色谱柱3。这种条件下，在8min内所用分析物都能被完全分离。3.2 蛋白质表征与可靠定量的IS选择当在蛋白质水平定量时，只有与分析物序列和物理化学性质相似的蛋白质才能符合IS的要求。由于牛-La的物种变体具有高度序列相似性，人-La被选作此研究的IS。人-La、牛-La、-Lg A，-Lg B序列如图1所示。人-La与牛-La序列具有高度相似性（72%），其性质如分子量PI也与牛-La的性质很匹配。因此，在整个分析过程中人-La与牛-La显示相同的行为，因此是非常合适的IS。此外，其色谱和质谱行为也被评估了。图2显示了牛-La、-Lg A、-Lg B和人-La（IS）的混合物的色谱检测量
14、，每个样品浓度都为50gmL1（也就是，牛-La，3.5106mol L1；-Lg A，2.7106mol L1；-Lg B，.7106mol L1；人-La，3.6106mol L1）。人-La在色谱时间轴上的位置表明其非常适合用来做IS。人-La、牛-La、-Lg A和-Lg B的原始质谱和解卷积后的质谱现在在图3中。牛-La和人-La的CSDs是相等的，显示荷电状态在5+至13+，最大值为6+(图3a和b)。解卷积后的质谱显示，存在的主要成分是：牛-La的分子量为14178碎片、人-La的分子量为14070碎片、牛-Lg A的分子量为18363碎片和牛-Lg B的分子量为18276碎片。
15、所有数据都与以前文献高度吻合。因此，人-La具有良好的分析行为，可以被用作IS。3.3 基质效应评估尽管人-La的检测表现行为和牛-La相似，但是与牛-Lg A和-Lg B之间存在显著差异。因此，为了确保两个-Lg变体的精确定量，必须考虑基质效应。采用两种普通方法来评价基质效应：柱后注入法和抽出后加标法。住后注入法主要适用于基质效应定性评价。相反，抽出后加标法主要用来定量评估基质效应。存储溶液被用空白基质或水稀释来获得一系列分析物浓度。信号抑制/增强（SSE）效果采用公式（1）计算。结果显示所有的蛋白质都会受基质影响：人-La和牛-La显示相似SSE程度（牛-La，97.1%；人-La，98.2%），而牛-Lg A和-Lg B的信号强大都被显著增强了（-Lg A,245.4%;-Lg B, 254.1%）。这可能是因为-Lg与-La的蛋白质序列、稳定性和CSDs完全不同，所有被基质影响的程度也不同。为了确保定量的可靠性，测试中IS和基质校正同时被引入：IS用来校正样品制备中的回收率损失，而基质校正被用来消除离子化效应。
