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1、实验报告实验名称中性粒细胞和巨噬细胞吞噬功能测定实验日期院系医学院专业医检班级姓名学号、实验目的熟悉吞噬细胞吞噬功能测定的原理和方法，了解吞噬细胞在固有免疫中的作用。二、实验器材显微镜、擦镜纸、洗瓶、注射器、眼科剪、镣子、医用棉签、塑料吸管、试管架、小试管、弯盘、载玻片、洗耳球试齐I75%酒精、瑞氏染液A液、瑞氏染液B液、3.8%枸檬酸钠、菌液、香柏油、6%可溶性无菌淀粉肉汤、1%鸡红细胞悬液动物小白鼠三、实验原理1 .吞噬细胞有两类，大吞噬细胞包括组织中的巨噬细胞和血液中的单核细胞；小吞噬细胞即血液中的中性粒细胞，又称多形核白细胞（PMN）。吞噬细胞是固有免疫系统的主要效应细胞，也是适应性免
2、疫应答中的一类关键的细胞，广泛参与免疫效应与免疫调节。吞噬细胞功能的测定对了解机体免疫功能具有重要意义。2 .巨噬细胞吞噬功能试验（大吞噬）巨噬细胞是机体天然免疫的主要免疫细胞，对异物（细菌、绵羊红细胞、鸡红细胞等）具有吞噬和消化的功能。吞噬率（吞噬百分比和吞噬指数）可直接反映巨噬细胞的吞噬功能。小鼠腹腔内注射硫代乙醇酸钠或淀粉肉汤等，诱导巨噬细胞的渗出聚集。两日后小鼠腹腔内注入鸡红细胞悬液，一小时后解剖收集腹腔吞噬细胞，涂片染色，镜检观察吞噬细胞对鸡红细胞的吞噬现象。3.中性粒细胞吞噬功能试验（小吞噬）小吞噬细胞即血液中的中性粒细胞，其胞浆内含有许多酶类，杀菌等过程来吞噬和消化衰老、死亡细胞
3、及病原微生物等异物，部分。可通过体内、体外法来测定其吞噬作用。它们通过趋化、调理、吞入和是机体固有免疫的重要组成4 .油镜原理:使用油镜时，需在玻片上滴加香柏油的原理是由于自标本玻片透过的光线，因介质（玻片一空气一接物镜）密度不同，部分光线发生折射而散失（如图中A-A）使射入物镜的光线减少，在使用高、低倍镜时，透镜的孔径比较大，影响尚不显著；但应用油镜头时，因透镜的孔径小，进入的光线则不够，致使物象显现不清。当油镜与标本片之间加香柏油后，香柏油的折射率（n=1.515）和玻璃的折射率（n=1.52）相近似，因此可增加进入透镜的光线（如图中CC）,使视野的亮度加强，物象也就看得清楚。，工汽，波笛
4、器5 .瑞氏染色1）原理：瑞氏染色法使细胞着色既有化学亲和反应，又有物理吸附作用。瑞氏染料由酸性染料伊红和碱性染料美蓝的氧化物（天青）组成，其深于甲醇后，解离为带正电的美蓝和带负电的伊红离子。各种细胞由于其所含化学成分不同，对染料的力也不一样，因此，染色后各细胞呈现出各自的染色特点。2）配制：（1） A液：瑞氏染粉0.1g,甲醇（AR）60ml。将瑞氏染粉放入清洁干燥研钵中，先加少量甲醇，充分研磨使染料溶解，将已溶解的染料倒入棕色试剂瓶中，未溶解的再加少量甲醇研磨，直至染料完全溶解，甲醇全部用完为止。染液配好后放于室温下，一周后即可使用。（2） B液：瑞氏染液B液为磷酸盐缓冲液，其配制方法为：
5、称取磷酸二氢钾（无水）0.3g,磷酸氢二钠（无水）0.2g；加蒸储水至1000ml使其溶解。配好后的磷酸盐缓冲溶液应校正pH值，其范围在pH6.46.8即可，然后塞紧瓶口备用。四、实验过程及步骤（一）中性粒细胞的功能测定1 .实验前准备：选择小鼠尾静脉注射的器材。向小试管中注射0.2ml3.8%枸檬酸钠（抗凝血才能进行细胞学试验；未抗凝血，血细胞被凝集，不能进行后续的细胞学试验）。菌液制备：自色葡萄球菌接种于肉汤培养基中，37c温箱培养12小时左右，置水浴中加热100C,10分钟杀死细菌，用无菌生理盐水配制成每毫升含6亿个细胞，分装于小瓶内，置冰箱保存备用。2 .采血：采血前对小鼠尾部和剪刀用
6、75%的酒精消毒。用剪刀在距离尾根部5cm处剪断小鼠尾巴，再用加入枸檬酸钠的小试管采集血液0.2ml左右，摇匀。对小鼠进行及时止血，否则易失血过多而死亡。3 .向含血液的小试管加入菌液：向小试管加入菌液后用塑料吸管吹洗三次，充分混匀，使血液中的吞噬细胞和细菌充分接触，促进吞噬。4 .水浴：37c水浴锅中保温20分钟，每隔10分钟取出小试管混匀1次，以使吞噬细胞与细菌充分接触和作用，促进吞噬。（吞噬细胞的活性在接近体内温度的条件下最强，温度太高细胞活性下降且容易死亡）5 .血涂片的制作：在载玻片的一端滴加一滴水浴后的血液，用另一个载玻片与载玻片间角度30。推片，用力匀，勿使太薄（白细胞多集中于边
7、缘）或太厚（细胞重叠缩小）于玻片上影响标本的清晰度。6 .染色：1）待血涂片干燥后，用瑞氏染液A液染色1分钟（染液要适量，能够覆盖住血液即可，一般1-2滴）。2）加瑞氏染液B液染色的过程中，用吸耳球吹吸混匀（使染色均匀，避免染料颗粒沉积）3）染色过程中避免血涂片干燥，实时加入相应染色保持湿润，以保证染色效果。4）用细水流斜着冲去染液，对着血涂片位置冲洗，有可能把血涂片样本冲掉，导致操作失败。7 .显微镜观察：1）先在低倍镜（10倍镜）下观察样本，确定合适的观察视野，应选择厚薄均匀、紫红色细胞较多的视野进行后续观察。4X物镜，视野大，但放大倍数较小，不容易观察细胞。2）在要观察的载玻片部位滴加香
8、柏油用油镜头观察，可较好的观察小吞噬的实验结果。由于油镜头孔径较小，需要充足的光线，因此，需对光源、光圈、聚光镜进行调节，使光线处于最强状态。3）中性粒细胞核形态多样，主要呈分叶状，中性粒细吞噬时，可见细胞核与被吞噬的细菌均染成紫色，细胞浆则为淡红色。8.判断结果:吞噬率=200个中性粒细胞中吞噬细菌的细胞数moo彳200吞噬指数二20Q个中性粒细胞中吞噬细菌的总数200测定中性粒细胞的吞噬率和吞噬指数可判断其吞噬功能。中性粒细胞吞噬功能是其最重要的生物功能之一，健康人吞噬率为61.464.2%,吞噬指数为1.011.11。吞噬率和吞噬指数增高，反映中性粒细胞吞噬异物功能的增强，常见于细菌性感
9、染。对疑有中性粒细胞吞噬功能低下者，有帮助确诊的价值。（二）巨噬细胞功能的测定1 .实验前准备1）小鼠腹腔注射淀粉肉汤：75%酒精对小鼠腹部皮肤消毒后，腹腔注射1ml6%可溶性无菌淀粉肉汤。2）淀粉肉汤配置方法：牛肉膏0.3g、蛋白月东1.0g以及氯化钠0.5g溶解于蒸储水100ml,加热后加入可溶性淀粉5g,溶解后高压灭菌，4c保存。使用前水浴融化，恢复到室温使用。2 .注射鸡红细胞1 ）75%酒精对小鼠腹部皮肤消毒后，小鼠腹腔注射1ml1%鸡红细胞悬液。（被吞噬的鸡红细胞时间过长可被消化，时间过短未被吞噬，必须掌握好吞噬作用时间，以30分钟为宜）2 ）1%鸡红细胞悬液配制方法：自鸡翼下静脉
10、或心脏采血，放入Alsever液中保存（鸡血与Alsever液1：4混合），置4c保存备用（可有效保存1个月）。临用前用5-10倍量的生理盐水将CRBC洗涤3次，取沉淀红细胞，加适量生理盐水按红细胞压积配成1%CRBC悬液。3 .吸取腹腔液、涂片1）小鼠处死后固定，暴露腹部。2）用75%的酒精对小鼠腹部皮肤、剪刀、镣子消毒。3）镣子提起小白鼠皮肤，用剪刀破开再扩展开皮肤，使之与肌层分离；再用相同的方法剪开肌层。剪开小白鼠腹腔时应避免出血，否则将影响巨噬细胞的浓度。4）塑料吸管吸取腹腔液，均匀涂在载玻片上。涂片的厚薄应适当，否则影响计数。4 .染色1）在涂片上滴加瑞氏染液A液1-2滴，恰好完全覆
11、盖样本涂片为宜。染色2分钟。2）加瑞氏染液B液染色，过程中用吸耳球吹吸混匀。（使染色均匀，避免染料颗粒沉积）3）染色过程中避免血涂片干燥，实时加入相应染色保持湿润，以保证染色效果。4）用细水流斜着冲去染液，对着血涂片位置冲洗，有可能把血涂片样本冲掉，导致操作失败。5 .显微镜观察：1）先在低倍镜（10倍镜）下观察样本，确定合适的观察视野，应选择厚薄均匀、紫红色细胞较多的视野进行后续观察。4X物镜，视野大，但放大倍数较小，不容易观察细胞。2）在要观察的载玻片部位滴加香柏油用油镜头观察，可较好的观察小吞噬的实验结果。由于油镜头孔径较小，需要充足的光线，因此，需对光源、光圈、聚光镜进行调节，使光线处
12、于最强状态。3）镜下可见巨噬细胞核呈蓝色，被吞噬的鸡红细胞呈椭圆形，其胞浆呈红色而核被染成蓝色。6 .结果判断测定巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数可判断其吞噬功能。本实验易于操作、结果直观、费用低廉，可以观察到小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞不同阶段的情况，多用于研究某些药物免疫调节功能的动物实验中，但不方便直接用于临床检查。吞噬率=(200个巨噬细胞中吞噬CRBC的巨噬细胞数/200)*100%吞噬指数=200个巨噬细胞中吞噬CRBC的总数/200五、实验总结实验(一)注意事项(1)抗凝剂用3.8%构椽酸钠。肝素抗凝血作白细胞分类计数时，白细胞的着色不佳。经wright染色后出现深蓝色背景，影响显微镜检查
13、。(2)制血片时，推片与载玻片间角度为30度，用力均匀，勿使太薄(白细胞多集中于边缘)或太厚(细胞重叠缩小)。于玻片上影响标本的清晰度。(3)如白细胞偏低，可用低渗方法破坏红细胞后再离心涂片。(4)水浴箱升温较慢，需在实验前预先开机调温，并保证有足够的水，其液面要高于需水浴的小试管的液面。(5)75%酒精是常用的外用消毒剂，95%酒精能将细菌表面的蛋自质膜迅速凝固进而阻止酒精进入细菌体内，不能很好杀死细菌。实验(二)注意事项(1)实验前3天小鼠腹腔注射淀粉肉汤溶液，淀粉肉汤溶液中的淀粉、蛋白质等大分子可预免疫小鼠，可诱导巨噬细胞大量产生并渗出至腹腔中，增强巨噬细胞吞噬活性。(2)涂片的厚薄应适当，否则影响计数。(3)用瑞氏染液染色时，要先将染液倾去后再冲洗，以免染液中细小颗粒附着于玻片上影响标本的清晰度。(4)剪开小臼鼠腹腔时应避免出血，否则将影响巨噬细胞的浓度。(5)掌握好吞噬时间，以免鸡红细胞被完全消化，造成吞噬率偏低。六、教师评价
