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1、精品论文推荐从活性污泥中培养驯化分离苯酚降解菌的实验研究张 慧 河海大学环境学院，南京（210098） E-mail:摘要：苯酚是造纸、炼焦、炼油、塑料、农药、医药合成等行业生产的原料或中间体。随着经济的发展，未经处理的含酚废水对人类的生存环境已经造成了严重的威胁。利用微生物 降解的方法处理含酚废水是一种经济有效且无二次污染的方法。在生物处理过程中，由于含酚废水的难降解特性，因此引入的菌种要有较强的降解苯酚能力，能较好地适应冲击负荷的变化。本文研究的是含苯酚废水的生物处理，即以培养高效菌株为主要研究内容，从吉林省 长春市第一汽车厂的污水处理站的污水、污泥中筛选到几株高效的苯酚降解细菌，能够在以
2、苯酚为唯一碳源和能源的培养基上生长。该菌株菌落呈白色，表面光滑。研究采用逐渐提高 苯酚浓度的方法驯化苯酚降解菌，使其对苯酚的降解能力从 300mg/L 提高到 1000mg/L 。从对驯化培养的菌株对苯酚降解率探讨可知，该菌株的生长和对苯酚的降解是基本同步的，而 且由于各菌之间存在协同降解作用，混合菌株对苯酚的降解在各方面都优于纯菌种。关键词：苯酚废水；生物降解；驯化；苯酚降解菌1. 引言随着石油化工、塑料、合成纤维、焦化等工业的迅速发展，各种含酚废水也相应增多， 其中以低温土法炼焦排出的低温炼焦油和其废水中含酚量最多。对焦化厂废水的深入研究已 经证明稀氨水是酚的主要污染源时，其他废水也一定含
3、有相当数量的酚。酚能使蛋白质变性， 高浓度时能使蛋白质沉淀，它对各种细胞都有直接损害作用，对皮肤和粘膜有强烈的腐蚀作 用。长期饮用被酚污染的水，可引起头昏、出疹、骚痒、呕吐、腹泻和精神不安。目前，降解水中酚类物质的方法有吸附法1-3、萃取法4-6、化学氧化法7-9、湿式氧化法 10-13、催化氧化法、光化学氧化法、光化学催化氧化法14-17，但是运用物理和化学处理含酚 废水不仅存在着二次污染，而且不经济，因此本论文研究利用经济有效且无二次污染的微生 物降解的方法来处理含酚废水。从含苯酚的废水中分离筛选对苯酚有降解活性的菌株，并筛 选出降解苯酚效率较好的菌株;采用不断提高苯酚浓度的驯化方法逐渐增
4、强菌株的降解能力; 测定菌株的苯酚降解能力及其生长曲线。2. 苯酚降解菌的分离筛选和驯化2.1 菌种来源活性污泥于 2008 年 3 月 26 日取自长春第一汽车污水处理厂曝气池，取回后放在透明的 容积约 5L 的玻璃瓶中曝气，每天早上停止曝气取出适当的污泥观察 30 分钟沉降比，生物 相，取静置后的上清液测定 pH 值，COD 及挥发酚含量。2.2 实验方法挥发酚：4-氨基安替比林分光光度法 18 酚类化合物于 pH 10.0-10.2 介质中，在铁氰化 钾存在下，与 4-氨基安替比林反应，生成橙红色的叫跺酚安替比林染料，其水溶液在 510mn 波长处有最大吸收。COD：重铬酸钾法pH 值：
5、数字 pH 计- 1 -微生物量的测定方法：比浊法19是在分光光度计或浊度计上进行测定培养液中微生物 的数量。在某一波长的光线，通过混浊的液体后，其光强度将被减弱。入射光与透过光的强 度比与样品液的浊度和液体的厚度相关。式中:It:透射光的强度;I0:入射光的强度;K:吸光系数;c:样品液的浊度;d:液层厚度;It/I0:透光度 (transmittance) 如果样品液层厚度一定，则 OD 值与样品浊度相关，根据此原理，可通过测 定样品中的 OD 值来代表培养液中的浊度，即微生物量。菌落生长曲线的测定：721 型分光光度计在 600nm 波长处测定吸光度值。2.3 苯酚降解菌的培养驯化阶段2
6、.3.1 营养的添加采用逐步提高苯酚浓度的方法：在一定容积的 5L 污泥中，苯酚的投加量在不同时间段 的变化为：3 月 28 日到 4 月 4 日 8 天内 1000mg/l 的苯酚的投加量由 100ml 增加到 500ml；4 月 5 日到 8 日 2000mg/l 由 100ml 到 500ml；4 月 9 日到 11 日 3000mg/l 投加量为 400ml；4 月 12 日到 13 日 4000mg/l 由 400ml 到 500ml；4 月 14 日到 5 月 29 日 5000mg/l 由 400ml 到600ml。2.3.2 出水的挥发酚在从 3 月 29 日开始测定挥发酚直到
7、 4 月 29 日的一个月的时间内，挥发酚的吸光度值在0 到 0.007 之间波动。说明我们前一天加入的苯酚在第二天经过了 24 小时的微生物代谢已经 基本被降解了2.3.3 生物相的观察及菌相的变化 每日观察生物相，开始时由于取自曝气池生物相种类多，主要有：累枝虫，漫游虫，钟虫，变形虫，漫游细菌，草履虫，聚缩虫等。在随后的驯化培养期时，主要有：菌胶团，轮虫，累枝虫，还有一些盖虫，壳吸管虫。在中间有时由于一些原因出现污泥膨胀这时生物相 比较单一，主要是：轮虫而且非附着型，丝状菌明显增长。总的来看，生物相比较稳定(如图 1-5)。图 1 变形虫图 2 轮虫图 3 累枝虫图 4 钟虫图 5 菌胶团
8、2.3.4 pH 值的变化我们坚持测定了 54 天的 pH 值。PH1086PH4200 20 40 60图 6 pH 随时间的变化图由图 6 可以看出，pH 值在 5-7 之间波动，波动范围不大，而且一般在 6-7 之间，说明 该类微生物比较适宜于偏中性的环境。2.3.5 代谢产物（COD 的变化）根据 pH 的变化，我们考虑是苯酚的代谢过程中有少量的酸性物质积累，还有微生物的 代谢物含有酸性物质，故根据 COD 在代谢周期（通常为一天）内是否可以降到 30mg/L 以 下，来判断苯酚的降解是否完全。40003500300025002000150010005000010203040系列1图
9、7 COD 在 30 小时内的降解过程图由图 7 可以看出在最初的两小时内，微生物降解有机物的速率快，能力强，以后降解过 程渐缓，可见有机物并没有被完全降解，故可知在苯酚的代谢产物中仍含有有机物。2.4 苯酚降解菌的分离及生理生化性质2.4.1 固体培养基的分离，纯化1）富集培养基培养基的配制（g/L）：牛肉膏 5g，蛋白胨 10g，琼脂 20g，NaCl5g，定容到 1L 的锥形瓶中。再在 121-126C温度下高温高压灭菌半小时，灭菌后放入苯酚 0.4g（由于苯酚易挥发）。目标菌的接种： 将培养基，培养皿以及接种需要的用具高温高压灭菌后，放在超静工作台上，备用。取沉淀后含有目标菌的上清液进
10、行倍比稀释，分别为：原水上清液，10-1，10-2，10-3 四个倍比。 然后在已灭菌的到入培养基的培养皿上进行平板涂布。培养条件及菌落观察：把接种完毕的培养基倒放入生化培养箱中，在 27C 下恒温培养数天，每天观察菌落的 生长情况。在放入培养箱的第二天四个倍比稀释的培养基中都出现菌落，有黄色和白色两种， 其中白色居多，表面光滑，同时发现菌落下的培养基出现色变反应，变为黑色。2）选择培养基培养基的配制（g/L）：KH2PO4 0.4g, MgSO4 0.2g, NaCl0.2g, NH4Cl0.8g,微量 Fe，Mn，琼脂 20g 定容到1L 的锥型瓶中，再在 121-126C 温度下高温高压
11、灭菌半小时，灭菌后加入苯酚 0.4g（苯 酚易挥发）。目标菌的接种：在选择培养基上我们采用了两种接种方式：将富集培养基上长出的菌落通过划平板接 种在选择培养基上（苯酚的浓度为 400mg/L），分别划平板接种黄色，白色两种。直接将 四个倍比稀释的混合菌上清液平板涂布在选择培养基上。培养条件及菌落观察：把接种的培养基放入恒温生化培养箱中 27C 下培养数天，在经过几天的观察中发现接 种黄色菌落的培养基未有新菌落长出，而接种白色菌落的培养基有菌落长出，说明黄色菌落 非目标菌，即不可降解苯酚。在直接接种的四个倍比稀释的培养基上都长出菌落，其中 10-3 的平板上菌落明显清晰。进一步有以同样的方式再次
12、接种划线，达到三级纯化。图 8 黄色菌落图 9 白色菌落（目标菌）2.4.2 液体培养基的筛选分离1）液体选择培养基培养基的配制（g/L）：KH2PO4 0.4g, MgSO4 0.2g, NaCl0.2g, NH4Cl0.8g,微量 Fe，Mn，定容到 1L 的锥型 瓶中，再在 121-126C 温度下高温高压灭菌半小时，灭菌后加入苯酚 0.4g（苯酚易挥发）。目标菌的接种：取灭菌后的 5 个广口瓶在其中分别到入 100mL 的液体选择培养基，然后分别向每个广 口瓶中加入 5mL（系列 1），10mL（系列 2），20mL（系列 3），30mL（系列 4），50mL（系 列 5）的含混合菌的
13、上清液。培养条件及菌落观察：把这 5 个广口瓶封口放入 30C，120r/min 的恒温摇床振荡，每天（24h）通过在 600nm 波长下测定 OD600 值，观察菌落的生长状况，并绘制生长曲线（如图 10）为后期实验研究 做准备。0.450.40.350.30.250.20.150.10.050-0.050 50 100 150 200 250系列1 系列2 系列3 系列4 系列5图 10 不同体积上清液的生长曲线注：纵坐标为吸光度，横坐标为时间，单位以小时计2.4.3 目标菌生长曲线的测定1）测定方法：721 型分光光度计在 600nm 波长处测定吸光度2）目标菌的接种：从固体选择培养基上
14、用接种环选取几个菌落放入液体选择培养基中，编号为 S1（系 列 1），S2（系列 2）；用移液管分别直接移取污泥上清液 1mL（系列 3），3mL（系列4），5mL（系列 5）于液体选择培养基内。3）生长曲线的绘制：1.210.80.60.40.2系列1 系列2 系列3 系列4 系列50020406080100120140160图 11 不同目标菌的生长曲线注：纵坐标为吸光度，横坐标为时间，单位以小时计4）分析：生长曲线反应了微生物的生长状况，分为 4 个期：适应期，对数增长期，减速增长期， 内源代谢期。从图中（横坐标为时间，以小时计；纵坐标为 OD 值）我们可以看出在 60-80 小时内，基本都达到了对数增长期，而系列 4 进入对数增长期较晚，而后这 5 个系列基本处 于平稳状态。影响微生物生长的主要参数为能函数，它是有机污染物量与微生物量的比值。 当微生物处于对数增长期时，降解有机污染物的能力强。2.4.4 目标菌对不同浓度的苯酚降解率的测定1.2
