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1、生物固氮和固氮菌的生产和应用前景引言：固氮作用是将空气中的氮气固定成氨。人类与许多其它生物一样需要氮素作为合成蛋白质的原料，但不能自我合成有机氮。虽然空气中有78%是氮气，但是绝大多数生物不能直接利用空气中的氮气。关键词：生物固氮 固氮菌 生产 根瘤菌 应用 研究方向1 生物固氮 生物固氮是指大气中的分子氮通过微生物固氮的催化而还原成氨的过程，生物界中只有原核生物才具有固氮能力。生物固氮反应是一种极其温和及零污染排放的生化反应，它比由人类发明的化学有着无比优越性，因后者需要消耗大量的石油原料和特殊的催化剂，并须在高温（300）、高压（300个大气压）下进行。此外，若不合理地使用氮肥，还会降低农
2、产品的质量，破坏土壤结构和降低肥力，以及造成环境污染（如湖泊的水华和海洋的赤潮）等恶果。我国在近半个世纪中，化肥产量猛增近6000倍（从20世纪50年代末的年产1万吨至2006年的约5600万吨），其有害影响已不断出现。因此，我们应该深刻认识到，只有深入研究、开发和利用固氮微生物，才能更好的发展发展生态农业和达到土地可持续利用的战略目标。如果吧光合作用看做是地球上最重要的生化反应，则生物固氮作用便是地球上仅次于光合作用的生化反应，因为它为整个生物圈中的一切生物的生存和繁荣发展提供了不可或缺和可持续供应的还原态氮化物的源泉。1.1 独立生活的固氮微生物光合固氮微生物能进行光合作用，以二氧化碳为碳
3、源、光合产物为能源进行固氮作用的微生物。有蓝细菌（见蓝藻门）中的许多属种（如念珠藻属、鱼腥藻属等）和光合细菌中的红螺菌属以及绿硫菌属等。化能自养固氮微生物有些化能自养微生物（如氧化亚铁硫杆菌等）能以二氧化碳、亚铁氧化物和分子态氮为碳、能、氮源。异养固氮微生物进行异养生活，以适宜的有机碳化合物为碳源和能源，满足生活和固氮的需要。这个生理、生态群包括许多种类，如固氮菌科的所有属、芽孢杆菌属、梭菌属的一些种、固氮螺菌属、肠杆菌科的一些属种、反硫化细菌、产甲烷细菌和其他一些异养细菌的种类。共生和联合固氮体系有些微生物种类只能或主要是在与其他生物营共生或联合生活时固氮。根瘤菌和豆类共生体系许多种豆类植物
4、能和根瘤菌属的相应种共生。根瘤菌侵入寄生根内，刺激寄主根上形成根瘤,根瘤菌在根瘤内定居并固氮。豆类植物和根瘤菌的共生关系具有属种的专性，一种或一株根瘤菌只能在一定的豆类植物种或品种上共生、结瘤、固氮（见根瘤菌科）。一些重要豆科作物种类和根瘤菌的专适共生关系如下： 1.2生物固氮反应的6要素a) ATP的供应 由于NN分子中存在3个共价键，故要把这种极端稳定的分子打开就得花费巨大能量。固氮过程吧N2 还原成2NH3 时消耗大量的ATP(N2 ：ATP=1:（1824)）是由呼吸、厌氧呼吸发酵或光合磷酸化作用提供的。b) 还原力【H】及其传递载体 固氮反应中需要大量的还原力（N2 ：【H】=1:8
5、）必须以NADPH+H+的形式提供。【H】由低电势的电子载体铁氧还蛋白或黄素氧还蛋白传递至固氮酶上。c) 固氮酶 固氮酶是一种复合蛋白，由固二氮酶和固二蛋白酶还原酶两种相互分离的蛋白构成，它们对氧都高度敏感。固二氮酶是一种含铁和钼的蛋白，铁和钼组成一个称为“FeMoCo”的辅因子，它是还原N2的活性中心。而固二蛋白酶还原酶则是一种只含铁的蛋白。某些固氮菌处于不同的生长条件下时，还可合成其他不含钼的固氮酶，称作“替补固氮酶”具有适应在极度缺钼环境下还能正常进行生物固氮的功能。d) 还原底物）N2e) 镁离子f) 严格的厌氧微环境。2.根瘤菌的生产和发展前景2.1目前，用于生产此类微生物肥料的菌种
6、主要有：园褐固氮菌或称为褐球固氮菌(Azotobacterchroococum)；棕色固氮菌亦称维涅兰德固氮菌(Azotobacterchroococum)；德氏拜叶林克氏固氮菌(Beijerinckiaderxii)和克氏杆菌属(Klebsiellaspp.)、肠道杆菌属(Enterobacterspp.)及产碱菌属(Alcaligenesspp.)中的某些菌种。圆褐固氮菌是固氮菌属中的一种，革兰氏阴性杆菌，细胞呈大卵圆形，大小2微米5微米，常成对，周生鞭毛运动，不形成芽胞，但能形成厚壁的胞囊和荚膜粘液。不产生水溶性的色素，但在琼脂培养基上的生长物具有特征性的非水溶性的褐色色素，有些菌株的这
7、种色素时间长会变成黑色。细胞内含有许多颗粒体，菌体外面有荚膜。需要说明的是，园褐固氮菌的菌体形态多变，幼龄时菌体为杆状，细胞单独存在或两个联接呈”8”字形，老龄细胞缩短，呈椭圆形或圆形。不同的园褐固氮菌菌株固氮作用存在明显差异，低的菌株利用1克葡萄糖仅能固定氮素5毫克，最高的可达20毫克。 棕色固氮菌也是固氮菌属中的一个种，在形态和培养特征上都非常相似，但能产生在紫外光灯下呈绿色水溶性的荧光色素；在琼脂培养基上的生长物具有特征性的非水溶性的棕色色素；它可利用鼠李糖，这是棕色固氮菌与该属的其它种的区别。 肺炎克氏杆菌(Klebsiellapneumoniae)的某些菌株发现有一定的固氮作用和刺激
8、作用，从分类的角度上看，该菌属于可能的条件致病菌，1997年山东潍坊医学院报导了9例新生儿脐带感染的9株病原菌中有4株是肺炎克氏杆菌。所以选用肺炎克氏杆菌作生产菌株必须进行有关毒性、病源等方面的鉴定，证明其无毒和非病源性后才能应用。l 在应用中须注意的几个问题：A.适用作物：多为禾本科，也有用于蔬莱；有小麦、玉米和水稻专用；也有不强调作物种类的。l B.使用剂量：符合国家标准的固体菌剂每亩地用量2501000克，液体菌剂每亩100200毫升。l C.使用技术：多为拌种，水稻还可用于插秧时的蘸根，也可用于作物生长关键阶段的叶面喷施。使用时尽量避免与速效氮联合使用，不能与杀细菌药剂、草木灰等同时并
9、用。使用时避免直射阳光，当天拌种，当天用完。l D.菌剂保存：由于是活的生物制剂，需要一定的保存条件，尤以温度影响较大，高温是菌剂保存时间长短的重要制约因素。剂型种类也对有效菌的保存有较大影响。l E.固氮菌肥与有机肥配合使用：有机肥对固氮菌的活动有良好的影响，在施用大量有机肥的同时使用固氮菌肥可获得好的增产效果。 2.2 1根瘤菌肥的应用原理将科学家经过各种手段筛选出来的固氮能力、侵染结瘤和竞争能力强的根瘤菌株制成根瘤菌肥，在豆科作物种植之前拌在种子上或接种在土壤里，以形成二者的共生固氮，达到增产和提高品质的目的。这是一条农业上事半功倍的有效途径。根瘤菌肥在我国应用的经济效益十分良好，投入和
10、产出之比在11020以上。2根瘤菌肥料的生产和应用根瘤菌肥料的生产过程与一般的微生物肥料的生产基本一致。但其对于无菌条件的要求更为严格，这是因为快生根瘤菌繁殖一代的时间34小时，慢生根瘤菌需810小时，这比各种杂菌来，显然要长得多。在生产中，稍有疏忽或设备上的小漏洞常常造成发酵失败。用于生产根瘤菌肥料的菌种较多，根据它们的生长繁殖速度可分为快生根瘤菌和慢生根瘤菌，它们的形态和鉴别特征简述如下。快生根瘤菌在培养条件下为杆状，大小是1.50.9微米1.23.0微米；在不利生长条件下或老龄时呈多形性；有26根周生鞭毛，或一根端生或侧生鞭毛，能运动；不形成芽胞；在相差显微镜下可见折光性的B-羟基丁酸盐
11、颗粒，使细胞染色不均匀，有时呈环节状；革兰氏染色阴性；菌落为圆形，半透明，半粘稠；在通用根瘤菌培养基上28培养23天，形成25毫米直径大小的菌落；利用碳源较为广泛，但不利用纤维素和淀粉；在甘露醇或其它碳水化合物培养基上生长产酸，并产生大量胞外多糖粘液；最佳生长温度为2530，最佳生长pH值为67。慢生根瘤菌的形态和鉴别特征和上述快生根瘤菌大体相似，但菌落多为不透明，呈白色、凸起；生长速度慢，在酵母-甘露醇培养基上28培养57天，其菌落直径不超过1毫米；在甘露醇或其它碳源上生长产碱。生产的根瘤菌肥料种类较多，不仅有用于大豆、花生、菜豆、绿豆等粮食、油料和蔬菜豆科接种剂，也有三叶草、苜蓿、紫云英等
12、豆科牧草或绿肥的接种剂。根瘤菌肥的剂型主要是液体和固体两类，固体剂型国内生产多为草炭粉剂，也有用肥土、稻壳、蛭石、褐煤、秸秆、堆肥、糖厂废料等作为吸附材料。用于吸附的载体细度须达到一定的要求，并需预先灭菌。载体灭菌的方法主要有射线灭菌、微波灭菌、湿热蒸气灭菌及瞬间干燥灭菌法等，载体的pH应在6.57.0左右。在实际生产中为了保证根瘤菌肥的功效，一些企业常采用种子球化(种子丸衣化)技术，即豆科作物的种子表面用粘着剂粘着根瘤菌剂，外面包上一些包衣材料如碳酸钙、保水剂、少量的化肥，然后播种。常用的粘着剂是羧甲基纤维素。根瘤菌肥料的应用中除了与其它微生物肥料的有效使用条件外，需强调的还有以下几点：A.
13、所用的根瘤菌剂必须与播种的豆科作物相一致，如有品系要求的更须对应。大豆根瘤菌只能用于大豆，用于豌豆无效，反之亦同。B.根瘤菌剂的质量必须合格。C.选好适宜地区和增施磷、钾肥。D.根瘤菌剂与钼及其它微量元素肥料的配合使用。这些都将提高根瘤菌使用效果。2.3生物固氮的应用及发展前景一方面，固氮细菌能为植物提供氮素营养，一定程度的抑制病虫害，从而减少化肥和农药的使用量，减少了它们对生态环境的污染。另一方面研究表明在重金属污染很严重的土壤中，有不少种类的根瘤菌可以生长，如长喙田菁一根瘤菌共生体系在重金属污染的环境中具有很强耐性和固氮能力。这方面的研究很多，但对根瘤菌抗重金属的研究不够成熟，有待选出一批
14、抗重金属强的固氮菌及其共生体系，另外也可以利用分子生物学手段构建抗重金属的工程根瘤菌，从而为生物修复重金属污染提供更多的途径。2.4生物固氮在农业生产中的应用生物固氮在农业生产中具有十分重要的作用。氮素是农作物从土壤中吸收的一种大量元素，土壤每年因此要失去大量的氮素。如果土壤每年得不到足够的氮素以弥补损失，土壤的含氮量就会下降。土壤可以通过两条途径获得氮素：一条是含氮肥料（包括氮素化肥和各种农家肥料）的施用；另一条是生物固氮。科学家在20世纪80年代推算过，全世界每年施用的氮素化肥中的氮素大约有8*107t，而自然界每年通过生物固氮所提供的氮素，则高达4*108t。对豆科作物进行根瘤菌拌种，是
15、提高豆科作物产量的一项有效措施。播种前，将豆科作物的种子沾上与该种豆科作物相适应的根瘤菌，这显然有利于该种豆科作物结瘤固氮。特别是新开垦的农田和未种植过豆科作物的土壤中，根瘤菌很少，并且常常不能使豆科作物结瘤固氮，更需要进行根瘤菌拌种。对比实验表明，在其他条件相同的情况下，经过根瘤菌拌种的豆科作物，可以增产10%20%。用豆科值物做绿肥，例如将田箐、苜蓿或紫云英等的新鲜植物直接耕埋或堆沤后施用到农田中，可以明显增加土壤中氮的含量。科学家统计过，一般地说，1hm2农田使用7500kg绿肥，可以增产粮食750kg。如果用新鲜的豆科植物饲养家畜，再将家畜的粪便还田，则既可以使土壤肥沃，又可以获得更多
16、的粮食和畜产品。2.5研究生物固氮的意义主要有以下两个方面。（1）能源问题。由于氮肥的制造是一个高耗能的过程，生物固氮研究的重要性一般都是在石油资源有危机的时候凸现出来。如上世纪70年代的石油危机，以及目前海湾地区的不稳定性和石油价格飞涨，都使生物固氮研究得到更加应有的重视。（2）环境压力。化肥施到土地里，只有30%被植物吸收，另外70%进入土壤水体，造成富营养化。有资料显示，我国农业对环境污染的“贡献率”达到20%以上，如滇池污染中，农业面源污染对于总氮、总磷含量的贡献率已分别高达43.3%和37.1%。因为我国是施用氮肥最多的国家之一，化肥作为一种农业生产资料得到国家的控制，相对比较便宜的同时，滥施现象也比较严重。而生物固氮
