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1、常用固定液的性质、用途和配置1. 单一固定液的性质和用途(1) 乙醇(C2H5OH) (ethylalcohol):又名酒精，可沉淀白蛋白、球蛋白、核蛋白，后 者易溶于水，所以经酒精固定的标本对细胞核染色不良。酒精可溶解脂肪、类脂体，所 以不能用酒精固定脂肪。酒精可沉淀肝糖，但仍可溶解于水，因此肝糖经酒精固定后不能在 低于70%酒精中保存。单独固定使用酒精的浓度应为95100%。无水酒精渗透力较差，并 且能使组织收缩，在与醋酸、氯仿混合使用时，可增强它们的穿透力。酒精除固定作用外， 还具有硬化和脱水的作用，固定后的组织可保存于70%酒精中，所以酒精在制片过程中用 途很大。无水乙醇容易挥发，又容
2、易吸收空气中的水分，所以瓶盖必须塞紧，为了吸去其 中水分，最好在无水乙醇瓶内放入少量无水硫酸铜粉末。酒精是一种还原剂，不能与重铬 酸钾、锇酸等氧化剂混合使用。(2) 甲醛(HCHO) (formeldehyde)：是一种气体，溶于水成为甲醛水溶液或称福尔马林， 一般使用浓度为10%福尔马林(formalin)液，其配法是取市售的甲醛液10ml与90ml蒸 馏水混合即可，实际上其含量只有4%甲醛。这样的配法已成为一般实验室常用的惯例。甲醛不能沉淀白蛋白及核蛋白，但能与蛋白质化合。它是一种应用广泛，使用简单的 固定液，具有穿透力强、固定均匀、组织收缩小、硬度适当，适用于一般器官组织的固定 及保存。
3、尤其对脂肪、神经组织固定效果较好。更适于病理组织的制片及大体积标本的保 存，一般组织需固定24小时以上，固定后的组织可移入50%酒精中逐步脱水。甲醛是一种强还原剂，不能与铬酸、重铬酸钾、锇酸等氧化剂混合，因极易被氧化 为甲酸。在配混合固定液时，如海利氏液等需临用前再加入，24小时后失效。甲醛由于长期贮存，特别是低温气候，容易产生多聚甲醛，即溶液中的白色沉淀， 在高温下又成为甲醛。不纯的甲醛易产生甲酸，使溶液变为酸性，影响核的染色。所以在 备用的福尔马林中加入小量的醋酸钙、碳酸镁或大理石作为中和剂。可用下法配制10%中 性甲醛溶液，pH为7.0左右： 40% 甲醛 100ml 蒸馏水900ml磷
4、酸二氢钠(NaH2PO4H2O) 4.0g磷酸氢二钠(Na2HPO4) 6.5g 甲醛醋酸钙溶液： 40% 甲醛 10ml 醋酸钙2g 蒸馏水加至100ml.(3) 醋酸(CH3COOH) (aceticacid)纯醋酸在低温时结成冰状故又名冰醋酸，约在17C 时融化，能和水及乙醇混合。使用浓度为0.35%，它能很好地沉淀核蛋白，对染色质的 固定效果很好。醋酸对染色体的保存能接近生活状态，因此在固定染色体的固定液中几 乎都含醋酸。醋酸的穿透力很强。它能使组织膨胀，常与其他药剂配合使用，起抑制其他固 定剂对组织收缩的作用。醋酸破坏线粒体和高尔基体，所以在线粒体和高尔基体制片及固定液中都不用醋酸。
5、(4)苦味酸(C6H2 (NO2) 3OH) (picricacid):是一种强酸，呈黄色结晶， 溶于水、 乙醇、苯和二甲苯。干燥时能自燃，爆炸，所以需湿性保存。一般配成饱和水溶液备用(100ml 蒸馏水加1.2g苦味酸)。苦味酸能沉淀蛋白质，对胞质固定较好。苦味酸的穿透力很慢，能使组织强烈收缩， 一般都与醋酸等药剂配合使用。苦味酸固定的组织会出现黄色，可在低度酒精中加入少量 碳酸锂饱和水溶液，洗去黄色。如遗留少许黄色在组织中，对染色无影响。(5) 重铬酸钾(K2 CrO7) (potassium dichromate):呈橙红色结晶，可溶于水，有毒， 是强氧化剂，不应和乙醇混合。它穿透力强，
6、能使蛋白质变为不溶性，能保持细胞质的结 构与生活状态相仿，并用于线粒体和高尔基复合器的固定，但需与甲醛、氯化汞等混合使 用，是细胞学良好的固定剂。重铬酸钾固定的组织需经流水冲洗1224小时。(6) 铬酸(H2CrO4) (chromicacid):为强氧化剂，是一种弱酸，呈红色或浅褐色结 晶，极易潮解，所以最好配成1 %的水溶液保存。它是强烈的沉淀剂，不单独使用。硬化 程度中等。固定肝糖的效果优良，它使肝糖不溶于水。在固定线粒体和高尔基复合器的 固定液中都含有铬酸成分。铬酸穿透力较慢，不使组织收缩。固定后的组织需经流水冲洗 12小时以上，洗去铬酸，否则会发生沉淀，影响染色。(7) 氯化汞(Hg
7、Cl2)(mer cury bichloride):又称升汞，呈白色针状结晶，能升华， 是一种极毒的药品，对粘膜有腐蚀作用，使用时需特别当心。氯化汞能沉淀一切蛋白质，使蛋白质变性不溶于水，对一般染色效果很好，对固定线 粒体和高尔基体的效果也很好。氯化汞穿透力较弱，收缩力较大，所以一般与醋酸、甲醛 等混合使用。经氯化汞固定的组织会产生氯化亚汞沉淀，所以组织或切片需用0.5%碘酒 处理35分钟，除去沉淀物，然后用2%硫代硫酸钠水溶液去碘处理12分钟。(8) 四氧化锇(OsO4) (osmiuln tatroxide):又名锇酸(osmicacid)。是一种淡黄色 结晶体，为强氧化剂，不可与酒精、甲
8、醛混合，在配制使用过程中瓶皿需特别洁净，固定 浓度为12%水溶液。需用棕色瓶贮存于4C冰箱内。锇酸是固定脂肪的最好固定剂。穿透速度很慢，能均匀固定蛋白质，能保持细胞生活 时形态，不引起细胞收缩，对细胞质的保存较好，特别适用于线粒体、高尔基复合器的固 定。固定后的透明处理，用苯为透明剂可得良好的切片效果。锇酸价格极贵，毒性高，蒸 气易损伤眼睛及粘膜，使用时应加小心。锇酸固定的组织切片，不易被苏木精着色，需经 过漂白处理。Lacour漂白液的配制：20%H2O2 10ml80% 酒精 30ml将切片置此液中漂白412小时，移入80%酒精、70%酒精、50%酒精中各2分钟，蒸 馏水充分洗涤后，再进行
9、染色。以上简单的固定液各有优缺点，如无水酒精可固定肝糖，但不能固定脂肪，因脂肪易 溶于酒精。而锇酸能固定脂肪，氯化汞对蛋白质固定较好，冰醋酸可以固定核蛋白等，它 们只是对细胞的某些成分固定较好，而不能将所有成分都保存下来。如果互相配合使用，则 能取长补短，得到较好的固定效果，只有了解药品的性质，才能清楚各固定液的性能。下面 介绍几种常用的混合固定剂。2. 混合固定液的配制和性能(1) 包音氏(Bouins)固定液)苦味酸饱和水溶液75ml甲醛(40%) 25ml冰醋酸5ml本液在使用前配制。包音氏液为常用的良好固定剂，适用于无脊椎动物，组织学、胚胎 学均可应用。渗透力迅速，固定均匀，组织收缩少
10、。小块组织固定212小时，一般组织 固定1224小时，固定后用50%酒精洗涤数次。此液固定的组织适于苏木精、伊红等 染色。用马瑞氏三色染色，能得艳丽的图像。(2) 任克氏(Zenkers)固定液)重铬酸钾2.5g氯化汞6g蒸馏水100ml冰醋酸5ml配制时将重铬酸钾、氯化汞溶于加温的蒸馏水，冰醋酸临用前加入。此固定液适用于细胞 学、组织学的研究工作。固定时间一般需1224小时。固定后要用流水冲洗12小时，用 碘去汞。此液固定的组织适于一般染色，细胞核、细胞质染色较为清晰。（3）海利氏（Hellys）液重铬酸钾2.5g氯化汞6g蒸馏水100ml40%甲醛液5ml此固定液是将任克氏配方中的冰醋酸换
11、成甲醛液，甲醛也在用前加入，因在加 入甲醛24 小时后即生成沉淀而失效。固定时间1224小时。海利氏液为骨髓、脾、肝等造血器官 的较好固定剂。此液亦可保存线粒体，染色前需用碘去汞。（4）苏萨氏（Susas）海登哈音氏（Heidenhains）液：氯化汞4.5g氯化钠0.5g40 %甲醛液20ml三氯醋酸2g冰醋酸4ml蒸馏水80ml将4.5g氯化汞和0.5g氯化钠溶于80ml蒸馏水中保存。临用前取此液20ml，加入三氯 醋酸0.5g，40%甲醛5ml，冰醋酸1ml，混合使用。此液含有三氯醋酸和氯化钠，对较硬的组织有软化作用，如皮肤、蛔虫卵、昆虫幼虫等角 质层较厚的组织，食道、胃均能适用。它具有
12、渗透快、收缩小的优点。小块组织固定35 小时；大块组织，如皮肤固定1224小时。固定后可直接入95%酒精洗涤，勿入水或低 度酒精，否则易使胶原纤维膨胀。切片在染色前，用碘去汞。（5）卡诺氏（Carnoys）液纯酒精60ml氯仿30ml冰醋酸10ml此液穿透力强，对核固定优良，是细胞学制片常用的固定液。酒精能固定胞浆及沉淀肝糖， 冰醋酸能固定染色质并防止酒精过度硬化和收缩，氯仿可增加渗透力。小白鼠的睾丸和马 蛔虫的子宫固定需3050分钟，稍大一些的淋巴结、胸腺等组织，可固定12小时。时 间太长易使组织过度硬化，不利于切片。固定后直接入95%酒精洗涤，然后脱水、透明、 包埋。（6）酒精、甲醛（简称
13、A. F）液95% 酒精 90ml40% 甲醛 10ml如需要可加入0.5g的醋酸钙使其呈中性。此液有固定兼脱水的作用，用于病 理快速诊断 的制片，也适于肥大细胞的固定。23mm厚的病理组织在50C固定40分钟，一般室 温固定1220小时，固定后可直接入95%酒精脱水。总之，固定液的种类很多，用时可查阅制片方面的书籍。首先要根据实验目的，选 用固定液。但应用时必须首先了解各种混合固定液中的组成成分能否预先混合，固定后是 否需要洗涤，然后再开始配制固定液。固定液和保存液用固定液固定动植物整体或它的一部分组织和气管等，能保存组织内细胞的形态、结构及其 组成，尽量使它近于生活状态。固定液一般有防腐和
14、保存的作用，分为单纯固定液和混合固 定液。单纯固定液中最重要的有乙醇、福尔马林、醋酸、苦味酸、铬酸、重铬酸钾、升汞等， 前两种固定液是中学生物实验室常用的。单纯固定液的优点是简便，缺点是有一定的局限性， 不易达到理想的固定要求。混合固定液有几种不同的药液按一定的比例混合而成，使各自的 优缺点相互补充，成为较完美的固定液。这种固定液的制备虽比较麻烦，但是效果比较好。 常用的混合固定液是醋酸-酒精混合液、福尔马林-醋酸-酒精液、包因氏固定液等。常用的保存液大致跟固定液相同，主要是福尔马林、酒精、甘油以及由这些药物按比例配制 成的各种混合液。有时按特殊保存的需要，再保存液中增加某些药品(如原生标本的
15、保存液)。1、福尔马林福尔马林在固定组织标本时杀菌能力强，所以防腐性强，渗透力大，固定得快。永福尔马林 固定精细的解剖标本时，要跟甘油、酒精、石炭酸等混合使用。固定液常用的浓度是510% (根据材料的大小、性质和数量而定)。保存液常用的浓度是510%。用福尔马林作保存液，效果好且价格低廉。在配制福尔马林溶液(固定液或保存液)时，应将3740%的甲醛作为整个溶质来配。例 如配制5%福尔马林是取市售3740%甲醛溶液5毫升跟95毫升蒸馏水混合。实际上甲醛 含量只有1.92%，这样的配法已成为一般实验室常用的惯例。注意事项：(1) 福尔马林业在长期贮存中会产生蚁酸，可适量的加入碳酸钙或碳酸镁等碱性物
16、质进行 中和。(2) 福尔马林业作为保存液会慢慢挥发而致使浓度降低，并且福尔马林液再保存中往往形 成多聚甲醛，使浸液变浊，影响观察。所以，根据一定保存期的情况，可适当增加福尔马林 液的浓度或更换新液，以防标本变坏。其中如有白色沉淀物，加热后可使它溶解。(3) 市售的福尔马林液常带有酸性，能腐蚀石灰质，因此，最好不用福尔马林液浸制有石 灰质外壳的动物。2、酒精(乙醇)酒精也是常用的固定液，它有强烈的杀菌作用，对组织材料的渗透力较大，固定的快。但是， 它的脱水作用较强，在高浓度的酒精中容易使材料显著硬化和收缩。一般用于固定浸制标本 材料，分一级或二级固定，即70%或50%与70%的酒精。有些小型材料或精细的解剖材料，
