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1、正交设计优化黄瓜ISSR体系分子植物育种,2006年,第4卷,第3期,第439442页MolecularPlantBreeding,2006,Vo1.4,No.3,439442新思路,新技术,新方法NovelThinking&Technology正交设计优化黄瓜ISSR体系王佳梁国华缪曼珉陈学好扬州大学植物功能基因组学教育部重点建设实验室,扬州,225009通讯作者,chenxhliuyahoo.tom.ca摘要黄瓜是一种重要的蔬菜作物,品种资源较为丰富,利用分子标记进行黄瓜资源鉴定和分类,构建分子遗传图谱和基因定位方面已取得一定进展,目前应用的分子标记主要包括RAPD,AFLP和SS
2、R,尚未见有关于ISSR标记在黄瓜上的研究报道.ISSR主要是由单一引物且以重复序列为主要引物序列的PCR标记,其反响条件受模板DNA,TaqDNA聚合酶,M,dNTPs和引物等因素的影响.正交试验设计能明确各因素问的互作效应,建立最优化的反响体系.本研究利用这一方法,从To#酶,dNTPs,引物,M4种因素各3个水平来优化黄瓜ISSR反响体系.通过实验,在251xl反响体系中初步确定各反响成分为:lxPCRbuffer,1.5mmol/LM,25ng黄瓜模板DNA,ddH2o,1UTaq酶,2001xmol/LdNTPs,0.75panol/L引物.这一体系的建立为今后利用ISSR技术进行黄
3、瓜种质资源分类,遗传图谱构建和基因定位奠定了技术根底.关键词黄瓜,ISSR,正交OptimizationforISSRReactionSysteminCll,Cumi$sativusL.UsingOrthogonalDesignWangJiaLiangGuohuaMiaoMinminChenXuehaoKeyLaboratoryofEducationMinistryforPlantFunctionGenomics,YangzhouUniversity,Yangzhou,225009Correspondingauthor,chenxhliuyahoo .caAbstractCucumber(Cu
4、cumissativusL.)isaveryimportantvegetablecropwithallabundantgermplasms.Muchprogresshasbeenmadeonevaluationandclassificationofgermplasms,andmappingandgenelocalizationofcucumberwithmolecularmarkerssuchasRAPD,AFLPandSSR,ISSRisamolecularmarkertakingrepeatse-quencesasmajorprimersequencebasedonPCR.Orthogon
5、aldesigncandeterminateinteractionsofeachfactor,thereforebestreactionsystemscanbeestablished.Inthisstudyorthogonaldesign,itllthreelevelsoffourfactors(roqDNApolymerase,dNTPs,primerandMwasusedtooptimizethecucumberISSRreactionsystem.TheresultsshowedthatabetteramplificationofISSRwasobtained,iththereactio
6、nsystemcontainingIxPCRbuffer.1.5mmol/LMr,25ngtempleDNAofcucumber,1UDNApolymerase,200panol/LaNTEs,0.75panol/Lprimerinthetotalvolumeof251x1.Itprovidedthebasisfortheanalysisofdiversity,mapconstructionandgenelo-calizationofimportanttraitsincucumber,itllISSRmarkers,KeywordsCucumissativusL.,ISSR,Orthogona
7、ldesignISSR(inter-simplesequencerepeat)是由Zi-etldewicz等在l994年创立的一种简单序列重复区间扩增多态性分子标记.其原理是根据真核生物基因组中广泛存在的简单重复序列,设计出各种能与SSR序列结合的PCR单一引物,对两个相距较近,方向相反的SSR序列之间的DNA区段进行扩增,能比RFLP和RAPD提供更多的遗传信息.ISSR标记通常为显性标记,呈孟德尔式遗传,具有很好的稳定性和多态性(Tsuanuraeta1.,1996),DNA用量少,技术要求不高.与RAPD相比,ISSR更可靠,重复性更高,每个引物能产生更高的多态性,同时具备RAPD的简便
8、及易操作性;与RFLP,AFLP相比,IS.SR更快捷,稳定,平安性更高;与SSR相比,ISSR不需要预先获知序列信息,程序简化因而本钱更低.这分子植物育种MolecularPlantBreeding种技术现已广泛用于品种鉴定(CulleyandWolfe,20011,遗传作图(Wolfeeta1.,1998),基因定位,遗传多样性分析(李海生,2004,生物学通报,39(2):19.21)等方面.在水稻,油菜和大豆等作物上已广泛应用(何予卿等,2001;马朝芝等,2003;汪岚等,2004).黄瓜是一种重要的蔬菜作物,品种资源较为丰富,中国黄瓜育种工作自上世纪60年代以来取得了很大成绩,育出
9、了以津研系列为代表的一大批优良黄瓜品种.近年来,黄瓜分子育种已开始起步,利用分子标记进行黄瓜资源鉴定和分类,构建分子遗传图谱和基因定位方面已取得一定进展,目前应用的分子标记主要包括AFLP(李锡香等,2004a)和RAPD(李锡香等,2004b),尚未见有关于ISSR标记在黄瓜上的研究报道.由于ISSR主要是由单一引物且以重复序列为主要引物序列的PCR标记,所以其反响条件易受许多因素的干扰,如模板DNA,TaqDNA聚合酶,Mg2+,dNTPs,引物等浓度都能影响ISSR-PCR扩增的结果.各因素间互相影响,必须搞清各因素间的互作效应,才能建立最优化的反响体系;而正交试验设计具有均衡分散,综合
10、可比及可伸可缩,效应明确的特性,了解各因素之间的内在规律,较快地找到最优水平的组合(盖钧镒,2000).王彦华等(2004)和谢运海等(2005)分别在不结球白菜和水曲柳上运用正交实验设计的方法优化了ISSR反响体系.本实验从Taq酶,dNTPs,引物,Mg2+4种因素3个水平,对黄瓜IS.SR反响体系进行优化分析,皆在为今后利用ISSR技术分析黄瓜的种质资源,遗传图谱构建和基因定位奠定根底.1材料与方法表1PCR正交设计表Table1OrthogonaldesignofPCRreaction1.1材料黄瓜品种为Sumter,2005年3月15日在扬州大学农学院园艺系试验大棚内采用穴盘育苗的方
11、法培育幼苗,待幼苗长至2片真叶时取嫩叶于液氮中冰冻后在-40冰柜中保存.提取的DNA作为IS.SR.PCR反响体系的模板.实验用ISSR-PCR反响的Taq酶购自TaKaRa公司.经初步筛选的引物为A34,A34引物序列为GSG(GT),M,dNTPs购自上海生物工程公司.1.2DNA的提取采用改进过的CTAB法提取DNA.用0.8%的琼脂糖电泳检测DNA质量.1.3正交设计PCR体系采用k正交表设计,由Taq酶,dNTPs,引物和M4种因素各3个水平组成(表1).反响体系中总体积为251zl,包括1xPCRbuffer,模板DNA25ng,其它各成分按照表1加样,最后用ddH20补足.每个处
12、理做3次重复.反响程序为94预变性5rain;94C变性30s,52退火30s,72延伸75s,循环42次;72延伸10mira4保存.反响结束后,PCR产物在含有0.5g/mlEB的3.0%琼脂糖凝胶中电泳lh,UVP凝胶成像系统进行拍照分析.2结果与分析依据琼脂糖电泳条带的强弱和杂带的多少做直观分析.从图1中可以看到,13号处理中,条带很弱,roq酶用量为0.5U,但随着其它成分的增多,条交改优化黄瓜ISSR体系1PCR产物l皂泳缩:l9号址摊号.参丧1FigureIEectrophoresisresult0IlPCRproductsNore:【9:Treatmentnumbershowe
13、dII_Table带对增强4-6号处媸中,随为tU,条带鞍为清晰且亮度较大.特别是5号请晰皮和亮度最好.79处理c锄酶为1.5U.能扩埔山条带,经济的角度来看.T*ut酶(f?J用量为l较为适宜,此I_J知T*ut酶为反响的上要影响素4号和7号址理【J,dNTPs浓度均为150xmot,;L,-物车I对较少,丰带和副带不ij腽6号处理?1杂带较多,卫带少.9号处理扣扩增的条带多世不清晰.综合各素弩啦,5号处理,生带副带情晰亮度高为垃佳组台.H此得山.黄瓜ISSR.PCR反响t.总体秘为25ttl的最正确反响体系为:静lU,dNTPs2001xmol/L,引物075p.mol/L,M1.5mmo
14、l/L3讨论本文利用正交试验设计方法锕步建立并优化了黄瓜ISSR标记的PCR反虚体系这反响体系受诸多J剖素的影响包扦黄瓜酶,M浓瞍,dNTPs,引物和DNA模扳等备反响成分都会影响PCRr.物的生成和质量7曲DNA聚合鹣是PCR反响中不町缺少的浓度过高可引起非特异:扩增,浓度过低那么台成产物量减少一般用量为0525U.卉:本体系中以lu为合理用量M浓度对PCR扩增的特异性和产量有硅着的影响,M浓度过高,反响特异性降低,出现非特异性扩增,浓度过低那么会降低_啪DNA聚合酶的活性,使反响产物减少.本实骑设计1.5mmoFL,2.0mmoI,L,25mmol/L这3个水平最适浓度为I.5mmol/L
15、.dNTPs是PCR反响的原料.浓度过低会降低PcR物的产量,同时,dNTP能与M结合:浓度过高将使游离的M浓度降低本体系的适宜dNTPs浓度为200btsnol,rL.引物是获得PCR特异性反响的关键,每引物为0.1101xmoUL的浓度.以最低引物量产生所需的结果为,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,LL会增加引物之问形成二聚体的时机本实验采用的3个引物浓度梯度为025mol/L,0.50ttmol/k,0750.mol/L,综合比拟认为075mol/L比拟适合奉反J娅体系模板DNA的量与纯化枉度足PCR成败与否的天键王f,之,本实验虽然未对摸板DNA的浓度进行试验,根据同为葫芦科怍物西瓜E的研究成果l11】选择樘板DNA的量为25ng,取得了较为理想的结果就反响穿而言,变性,退火祁延伸的时间温度对反响结粜有定的影:响,特刖是退火温度埘其影响更_人.不fli_f的引物有其特异的退火温度本体系中引物退火温度根据经骀确
