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1、同步荧光法测定维生素 B，B，B 含量的条件研究126陆栋，何姗姗（浙江大学药学院）摘要： 本文研究了同步荧光法同时测定药物中维生素B1, B2, B6的测定条件。以/入=25nm1 2 6进行同步扫描所得到的三个同步荧光峰（以发射波长表示，分别位于412 nm ， 509nm， 379nm） 可以同时分别测定维生素B1, B2, B6。方法快速，灵敏。在最佳实验条件下，维生素B1，1 2 6 1B ， B 的工作曲线线性范围分别为 0.54ug/ml ， 0.252ug/ml， 0.040.3ug/ml。26关键字： 同步荧光法，维生素8“，维生素82，维生素B61 2 6维生素B2，B6本
2、身为荧光物质，维生素B1在碱性介质中发生硫色素反应生成硫胺荧后2 6 1 也可产生强荧光，三者常共存于同一样品中，所以三者的同时测定一直是荧光分析领域所探 讨的课题。荧光技术尽管灵敏度高，但对一些复杂混合物，比如维生素B1, B2, B6混合样126 品，其分析常遇到光谱互相重叠，不易分辨的困难，需要预分离后逐个分别测定，步骤繁琐。 本文利用同步荧光法使其三者的光谱简化，普带变窄，提高选择性，减少光散射干扰等特点， 得到了可以同时测定三者的同步荧光光谱，并考察了在最佳实验条件下的线性范围，建立了 一个快速，简便的荧光分析步骤。实验部分1. 仪器和试药JASCO FP-6500 荧光光谱仪，BO
3、LONG USC-302 超声仪，TELTA320 pH 计， 维生素B1,维生素B2,维生素B6：生化试剂，均为浙江大学药学院药物分析实验中心提供。1 2 6复合维生素B片：含维生素Bi3mg/片，维生素B21.5mg/片，维生素B60.2mg/片，批号1 2 620101101。维生素B（盐酸硫胺素）标准液：准确称取lOOmg硫胺素，用水定容至100ml，浓度为lmg/ml （溶液在棕色瓶中于5C冷藏）。放在棕色瓶中冷藏备用维生素B2（核黄素）标准液：准确称取50mg核黄素溶解于稀盐酸溶液中并定容至500ml，浓度 为100ug/ml。放在棕色瓶中冷藏备用维生素B （吡多辛）标准液：准确称
4、取50mg维生素B，用水定容至500ml，浓度为100ug/ml 66的贮备液，放在棕色瓶中冷藏备用1%铁氰化钾溶液：称取铁氰化钾溶液0.1g,用水稀释至10ml15%氢氧化钠溶液：称取7.5g氢氧化钠，定容至50ml。磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液：将0.2M磷酸氢二钾溶液与0.1M柠檬酸溶液按体积比6:1混合， 用柠檬酸溶液调节至pH=7.0 （Na2HPO4 : 174.14；柠檬酸：192.14）2. 实验方法取维生素B待测液适量于50毫升容量瓶中，加入缓冲液至10毫升，加入1毫升15%氢氧化 钠溶液和0.5毫升1%铁氰化钾溶液，摇匀，置于暗处1小时，摇动下加入稀硫酸至中性（用酚 酞指示）
5、。用缓冲液定容至刻度，摇匀。于下列仪器条件下进行荧光扫描及测定。:BANDPASSEx： 10nmEM ： 10nm ， SCANSPEED： 200nmmin， PM （能量增益） ： low， RESPONSE： 2s， BOTH SCAN： SET。从同步扫描确定波长差/入=25nm, V B 387nm/412nm, VB 484nm / 509nm, VB 354 / 379nm，为最佳测定波长。测得同步荧光值，由各自工作曲线计算其含量。6结果与讨论1.光谱扫描取维生素B标准液各1ml分别置于10ml容量瓶中，按实验方法处理。于入300600nm e入进行扫描，测绘各自的激发光谱和发
6、射光谱（图1）。维生素B， B勺荧光激发峰分别位于 16373nm和326nm，维生素B2的荧光激发峰有337nm, 403nm, 493nm （最强）三个。维生素 的荧光发射峰分别位于443nm, 531nm, 392nm。1 2 6Int.300600400 500Wavelength nmInt.6008425001600300400 500 Wavelength nm400 500 Wavelength nm350 400 450 Wavelength nmInt.300WavelengthInt.300600400 500Wavelength nm.A7RVBlnt.$y6300图1
7、维生素Bj, B2, 发光谱（上）和发射光谱（下）1 2 62.波长差/ 2选择各取维生素B, B , B 0.5ml, 2ml, 10ml于50ml容量瓶中，按实验方法处理后，选择1 2 6不同/入值（/入=10,20,25,30,40,50,60nm）扫描得其同步荧光光谱（图2）。结果表明随 着/入的增大，荧光信号也随之增大，但分离效果变差，综合分离效果和荧光信号强度两个 条件，本实验选择/入=25，如图3所示，此时三者明显分开，而且灵敏度较好。7060A I 40Int.AIYf1A20K ri0300 400 500 600 Wavelength nm图2波长差/入对同步荧光光谱的影响
8、10nm20nm25nm30nm 40nm50nm60nmWavelength nm图3维生素B、B和B的同步荧光光谱（/久=25）1263. 荧光稳定性考察取等量的维生素B、B和B标准混合液于一系列10ml容量瓶中，按照实验方法处理，其中126改变硫色素反应时间，将反应时间与相应的荧光强度作图（图4）,考察反应时间与维生素B图4 硫色素反应时间与荧光强度关系图4. 工作曲线取不同量的维生素B、B和B标准混合液于一系列10ml容量瓶中，分别用缓冲液稀释至刻1 2 6度，配成系列标准溶液（表1）。按实验方法操作，获得工作曲线（图5）。数据经回归处理 列于表2。o o O0 5 02 11荧光信号
9、1 2B BV V00.10.20.30.4浓度（ppm）图5维生素B, B2,B6H作曲线6表1 标准溶液的配制 1ml750ul500ul250ul125ulVB14ug/ml3ug/ml2ug/ml1ug/ml0.5ug/mlVB22ug/ml1.5ug/ml1ug/ml0.5ug/ml0.25ug/mlVB30.3ug/ml0.225ug/ml0.15ug/ml0.075ug/ml0.0375ug/ml表2 工作曲线的有关参数组分线性范围(ug/ml)回归方程R2VB10.5-4F=45.44C + 10.630.995VB20.25-2F=65.85C + 1.6540.999VB6
10、0.04-0.3F=35.94C + 1.0460.9985. 精密度实验配制6份维生素B、B和B混合液，按实验方法处理，平行测定，实验结果的RSD分别126 为4.27%， 1.47%， 1.44%。5.样品测定取20片复合维生素B片，称重为1.4669g,精密称定57.99mg于500ml容量瓶中。稀盐酸溶 解后用缓冲液定容至刻度，摇匀。经过滤后取滤液lml至10ml容量瓶中，按实验方法测定。 测定结果见表3.表3复合维生素B片含量测定结果组分标小量VB153.2%VB2102.2VB674.8%6. 讨论本实验成功测绘了维生素B1, B2, B6的同步荧光光谱图，探索了不同波长差/入对于
11、1 2 6各组分间的分离效果以及荧光灵敏度的影响，成功得到了最佳/入=25nm，在此基础上考察 了硫色素反应时间对于荧光稳定性的影响，以指导选择一个较合理的反应时间，尽量消除反 应时间误差所引起的荧光强度误差。本次实验的复合维生素B片的含量测定除维生素VB2的含量准确度较高外，维生素VB,VB的测定结果准确度都不高。我们根据自己实验设计以及相关文献，总结了一下几个方面6的影响因素：1硫色素反应虽为维生素B勺专属性反应，但并不是定量完成，由本实验的稳定性考察中 可发现此反应进行的较缓慢，在 2 小时内都未反应完全，因此可考虑采取一些能加速此反应 的措施，或者加入一些表面活性剂来稳定荧光强度。2.
12、有文献报道过量的Fe3+对VB勺荧光具有猝灭作用，适量的Fe3+对VB具有增强荧光强度的 作用,Fe3+则对VB和VB的荧光具有不同程度的猝灭作用。本实验中的样品所含的VB量明显2 6 1低于标准品，可能导致了相同浓度的Fe3+产生了不同的作用，影响了最后的准确度。因此在 进行硫色素反应时应保证样品与标准品各维生素B的含量相同，可能可以减弱此影响，提高 准确度。或者换其他氧化剂如氯化汞，溴化氰等，来消除Fe3+对于维生素B荧光强度的影响。3维生素B在碱性条件下易被破坏，由于硫色素反应需在碱性条件下进行，且为考虑到荧光6稳定性使得反应时间较长，从而使维生素B较长时间存在于碱性条件而遭到了破坏。6
13、4.复合维生素B片剂中的其他成分对于硫色素反应以及荧光测定具有一定的干扰。因为在严 格控制铁氰化钾和氢氧化钠用量，以及反应时间后，片剂中维生素B，B的荧光强度与标准16 品仍有较大差距。同时精密度实验的结果也从一定程度上论证了这一点。5.荧光分析灵敏度较高，且测定干扰因素较多。许多实验条件(如铁氰化钾用量，反应时间， 氢氧化钠浓度，溶剂pH值，标准液和样品的浓度)都需进行摸索，得到最好的实验条件。同 时在实验过程中需要很熟练和专业的操作规范，细小的失误都可能会给实验的最终结果带来 巨大的误差。7. 参考文献1 1胡益水，苏文周 同步荧光法同时测定维生素B和B【J】广州食品工生科技1994,2,
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