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1、响应曲面法优化亚麻籽蛋白提取工艺徐江波1，2，肖江1，2，陈元涛1，2*，张炜1，2，郭智军1，2 (1.青海师范大学润德亚麻籽工程技术研究中心 ，青海 西宁 810008；2. 青海师范大学化学系，青海 西宁 810008)摘要：以亚麻籽为原料，采用碱溶酸沉法提取亚麻籽蛋白。在单因素试验的基础上，应用响应曲面法研究浸提温度、pH、时间、料液比对亚麻籽蛋白提取率的影响，并建立该工艺的二次项模型。结果表明，回归模型具有高度显著性，可以对亚麻籽蛋白的提取率进行很好的分析和预测，并最终确定亚麻籽蛋白最佳工艺条件为：料液比1：20，提取时间90min，提取温度50，浸提液pH值为10，在此条件下的亚麻
2、蛋白提取率为79.26%，纯度达到92.34%。关键词：亚麻籽；亚麻籽蛋白；碱溶酸沉；提取；响应曲面 Optimization of extraction processing for flaxseed protein by response surface methodologyXU Jiang-bo1,2, XIAO Jiang1,2, CHEN Yuan-tao1,2*, ZHANG Wei1,2, GUO Zhi-jun1,2 (1. Runde Engineering technology research Center of Flaxseed, Qinghai Normal Uni
3、versity, Qinghai Xining 810008, P.R. China;2. Department of Chemistry, Qinghai Normal University, Qinghai Xining 810000, P.R. China)作者简介：徐江波(1983)，男(汉)，河北邯郸人，硕士研究生，主要从事青藏高原特色资源研究与开发；基金项目：青海省重点科技攻关项目(2007-N-120)；科技部科技人员服务企业行动项目(2009GJG20017)；教育部“新世纪优秀人才”支持计划(NCET-07-0476)。*通讯作者：陈元涛(1973)，男，教授，博士，研究方向
4、为天然产物化学。E-mail：Abstract: Alkali-solution and acid-isolation was used to extract flaxseed protein from flaxseed in this study. Based on singer factor test, response surface method was used to study effects of extraction temperature, extraction pH, extraction time and solid-liquid ratio on extraction
5、rate of flaxseed protein, and a second order quadratic equation for flaxseed protein extraction was finally obtained. The results showed that the model was of great difference, and the extraction of flaxseed protein from flaxseed was analyzed and predicted by the model. The optimum extraction of fla
6、xseed protein from flaxseed were solid/liquid ratio(g/mL)1:20, extraction time 90 min, extraction temperature 50, extraction pH 10.0, the extraction rate of flaxseed protein from flaxseed was 79.26% and purity reached 92.34% under the optimal conditions.Key words: flaxseed; flaxseed protein; alkali-
7、solution and acid-isolation; extraction; response surface method亚麻（Linum usitatissimum L.），亚麻科、亚麻属的一年生或多年生草本植物1，主要分布在北美、印度、中国等国家，是世界上最古老的纤维作物，品种较多，已成为世界十大油料作物之一2-4。亚麻籽（flaxseed 或linseed）是亚麻的种子，含有油脂和蛋白质等营养成分。其中，脂肪占31.937.8%，含有多种脂肪酸，尤其不饱和脂肪酸含量很高；蛋白质占21.931.6%，含有几乎所有种类的氨基酸，且氨基酸的评分较高，具有很高的营养价值2；另外，亚麻籽中还
8、含有一定量的亚麻籽胶，随品种和栽培区域不同而不同，约占种子质量的210%5。诸多文献6-9研究表明，油料蛋白质的提取主要有等电点沉淀、离子交换、碱溶酸沉法、反胶束溶液萃取、膜分离、酶法等方法，其中碱溶酸沉法是我国普遍采用的蛋白质提取工艺，该方法能够有效地提高蛋白质的提取率，充分利用蛋白质资源。响应曲面法（Response Surface Methodology）是利用合理的实验设计并通过对实验数据进行一定的处理，建立影响因素与响应值之间的函数关系，采用多元二次回归方程来拟合影响因素与响应值之间的函数关系，并通过对回归方程的分析来寻求最佳工艺参数，解决多变量问题，由于其精度高，目前在食品工业和天
9、然产物开发研究过程中应用广泛10-11。目前，尽管亚麻籽中含有大量的亚麻籽蛋白,但在我国应用亚麻籽提取亚麻籽蛋白的文献很少,更未见有规模化生产亚麻籽蛋白的报道。这是由于亚麻籽中富含亚麻籽胶，其具有黏性大、吸水性强、乳化效果强等特点12-14，会造成亚麻籽蛋白在提取过程中乳化、难离心、不易过滤等问题。因此，在对亚麻籽进行蛋白质的提取过程中，应该先对亚麻籽胶进行预处理。本课题组首先采用果胶酶法15对亚麻籽进行脱胶预处理，然后粉碎脱脂后采用响应曲面分析法优化亚麻籽蛋白碱溶酸沉的工艺条件，探讨料液比、浸提pH、浸提时间和浸提温度四个因素对亚麻籽蛋白提取率的影响，确定最佳的工艺参数，为亚麻籽蛋白的进一步
10、开发利用及规模化生产提供研究基础。1 材料与方法1.1原料与试剂亚麻籽 青海润德生物科技有限公司，挑选完整、饱满、无虫害的亚麻籽作为实验原料；果胶酶（酶活力10000u/mL）诺维信(中国)生物技术有限公司，盐酸、氢氧化钠、石油醚 北京化学试剂厂 ；以上试剂及其它化学试剂均为分析纯；蒸馏水 实验室自制。1.2 仪器与设备pH计 梅特勒-托利多(上海)仪器有限公司；LXJ-64-01离心机 北京医疗仪器修理厂；分析天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；LGJ-22型冷冻干燥机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；DHG-9140型电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；双层玻璃反应釜 上海申生科
11、技有限公司；K360 BUCHI步琪凯氏定氮仪 广州和竺生物科技有限公司；ZD-2上海雷磁自动电位滴定仪 上海恒磁电子科技有限公司；超级恒温器，上海市实验仪器厂；索氏抽提器；1.3 方法1.3.1 亚麻籽粉基本组成成分测量 水分测定：常压直接干燥法，参照GB 5009.3-2010；蛋白质的测定按照GB/T 5009.5-2010；灰分的测定采用灼烧重量法，按照GB/T 5009.4-2010；脂肪的测定采用索实提取器，按照GB/T 14772-2008；总纤维的测定按照GB/T 5009.10-2003。1.3.2 亚麻籽蛋白的制备1.3.2.1 原料预处理 首先用果胶酶对亚麻籽进行脱胶处理
12、，然后将脱胶干燥后的亚麻籽进行粉碎，并在常温下用石油醚脱脂3次，置于通风橱中12h以挥发溶剂，得脱脂粉，于冰箱5保存备用。脱脂亚麻籽粉中蛋白质含量采用凯式定氮法进行测定。1.3.2.2 亚麻籽蛋白的制备工艺流程 亚麻籽果胶酶脱胶干燥粉碎(过80目筛)脱脂碱溶浸提离心等电点沉淀离心洗涤冷冻干燥亚麻籽蛋白粉1.3.2.3 亚麻籽蛋白的具体提取步骤16-17 称取一定量脱胶脱脂亚麻籽粉与蒸馏水按一定料液比混合，用NaOH调至一定的pH，于一定温度下搅拌浸提30min，然后在以4000r/min离心20min。沉淀物再重复提取1次，合并2次上清液，用HCl调pH至等电点使蛋白质沉淀，再以4000r/m
13、in离心20min，用蒸馏水洗涤沉淀2次，再用NaOH回调至pH为7.0，搅拌使沉淀复溶后进行冷冻干燥，则可得到亚麻籽蛋白粉。1.3.3 碱溶酸沉提取亚麻籽蛋白试验1.3.3.1 等电点的确定 称取10.0g亚麻籽脱脂粉，料液比为1:20，用NaOH调节pH值至10，控制温度为50下搅拌浸提30min，然后在以4000r/min离心20min。沉淀物再重复提取1次，合并2次上清液，分别取上清液9份各25mL，加盐酸调节pH值为2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5后离心，弃上清液后称重，将上述过程重复一次，绘出沉淀量与pH值的曲线关系图，图中沉淀量最大时的pH值
14、即为亚麻籽蛋白质的等电点。1.3.3.2 料液比的确定 分别设定料液比为1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30(g/mL)，50，pH值为10下浸提90min，研究料液比对蛋白质提取率的影响，确定最佳的料液比。1.3.3.3 浸提pH的确定 料液比选择1:20，分别选择浸提pH值为8、9、10、11、12、13，温度为50下浸提90min，研究浸提pH值对蛋白质提取率的影响，确定最佳的浸提pH值。1.3.3.4 浸提温度的确定 料液比选择1:20，分别选择浸提温度为20、30、40、50、60、70，pH为10下浸提90min，研究浸提温度对蛋白质提取率的影响，确定最佳的浸提
15、温度。1.3.3.5 浸提时间的确定 料液比选择1:20，分别选择浸提时间为30、50、70、90、110、130min，在pH为10和温度为50下，研究浸提时间对蛋白质提取率的影响，确定最佳的浸提时间。1.3.4 碱溶酸沉工艺优化试验 依据单因素实验的结果，采用Box-Behnken进行试验设计，以料液比(g/mL)、浸提温度()、浸提pH及浸提时间(min)为影响因素，采用四因素三水平的响应曲面法进行试验，利用Design-Expert8.0.5b软件进行数据的处理和回归分析。分别用A、B、C、D来表示四个影响因素，并用+1、0、-1分别代表变量的水平，亚麻籽蛋白提取率为响应值，试验设计方案见表1。表1响应面设计实验因素与水平Table 1 Variables and levels in response surface design因素编码水平(xi)-10+1A料液比(g/mL)1:151:201:25B浸提温度()405060C 浸提pH91011D浸提时间(min)70901101.4 分析方法1.4.1 亚麻籽粗蛋白含量的测定 凯式定氮法；1.4.2 亚麻籽蛋白得率的计算亚麻籽蛋白得率(%) = 粗提产物中蛋白质含量脱脂粉总蛋白质含量100%2结果与讨论2.1 脱胶脱脂亚麻籽粉基本组分测定结果对脱胶脱脂后的亚麻籽粉进行成分测定，结果见表2
