辅助生殖技术

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1、辅助生殖技术辅助生育技术(artificial reproductive technology, ART)是指对配子、 胚胎或者基因物质等进行操作而获得新生命的技术，它包括各种帮助不孕症患者妊娠的 技术，如促排卵yao物治疗、人工授精(artificial insemina. tion, AH)和体外受精一胚胎 移植(in vitro fertilization&embo transfer, IVFET)及其各项衍生技术。目前在 ART 中 的研究热点是IVF ET及其各项衍生技术。常规IVF ET技术主要解决女性不孕问题， 特别是输卵管性不孕；在该技术上结合显微操作技术、分子生物学、

2、细胞遗传学等发展 起来的衍生技术主要包括有胞浆内单精子注射(intracytoplasmie sperm injection, ICSI)和 胚胎植入前遗传学诊断(preimplantation geneticdiagnosis, PGD)等。经过近20年的发展， ART已经取得了惊人的进步。目前，我国大陆临床ART在许多方面基本上与国际水平接 轨，不少中心常规IVFET的成功率已稳定在较高的水平1。本文主要阐述近年IVF 一 ET 及其衍生技术中涉及问题的研究进展。1 常规 IVF-ET常规 IVF-ET 是指从妇女体内取出卵子，体外培养后加入经过处理获能的精子使之受精， 受精卵发育成28个

3、卵裂球或囊胚后，移植入母体子宫内并使之着床。它的适应症为 女方输卵管性不孕、排卵障碍、子宫内膜异位症、免疫性不孕、男方轻度少精症、弱精 症或畸精症、原因不明不孕特别是经过其他助孕方法多次失败。主要程序包括控制性超 促排卵(controlled ovarian hyperstimulation, COH)、手术取卵、体外受精、胚胎体外培养、 胚胎移植等步骤。11 COH 方案的改进。IVF 能够获得成功的大前提是获得可以进行移植的优质胚胎， COH 的目的就是提供高质 量的卵子以获得更多的优质胚胎，从而提高成功率。1980年以来，全世界已广泛采用了 COH进行WFET技术。COH中所使用的yao

4、物主要 有促性腺激素(gonadotropin, Gn)和促性腺激素释放激素兴奋剂(gonadotropin releasing hormone analogue, GnRHa)。在IVF中联合应用GnRHa和Gn,可降低卵巢局部雄激素 水平，提高卵子募集率，使卵泡发育同步化，预防早发LH峰和卵泡过早黄素化，提高 了卵子质量,增加卵子回收率和受精率,从而减少取消周期,提高胚胎种植率和临床妊娠 率2。根据使用 GnRHa 的时间不同， COH 分为长方案、短方案、超短方案和长去敏方 案 4 种。 长方案：于使用Gn治疗前一周期的黄体中期开始用GnRHa，月经来潮d 3开始注 射.FSH/HMG。

5、长方案可以较好地抑制早发LH峰，增加治疗周期的卵子募集，提高卵 子和胚胎的质量,减少医源性的卵巢过度刺激综合征(ovarian hyperstimulation syndrome, OHSS)的发生。目前长方案已经被临床医生广泛接受并成为COH中的常规方案。 短方案：于月经d 2开始给GnRHa, d 3同时加用FSH/HMG。该方案主要 适用于卵巢低反应者。 超短方案：于月经d 2、d 3、d 4给GnRHa，于月经d 3开始用FSH/HMG。超短方案 中垂体敏感性恢复或LH上升可发生在最后一次GnRHa注射后的914 d,如超过12 d 或取卵时问延迟，还需监测LH或加d 2、d 3、d

6、4的GnRHa用量。该方案也主要适用于 卵巢低反应者。 长去敏方案：用长效GnRHa制剂13个月后，于最后一支yao后2840 d开始加用 FSH / HMG。此方案尤其适用于严重盆腔子宫内膜异位症和腺肌症患者。用yao期间B 超监测排卵，及时调整yao物剂量3。目前 COH 技术还有待精益求精，针对不同患者的基础激素状态、卵巢反应性等，选择 恰当的降调或刺激方案，以求增加成熟卵及可移植的胚胎数，减少OHSS的发生。近年 来开发了 GnRH拮抗剂(GnRH antago. nist)并开始临床应用，其特点是起效迅速，有效性 及安全性可与GnRHa媲美，使Gn的疗程缩短、剂量降低、停yao后垂体

7、功能恢复迅速、 不需黄体支持。 GnRH 拮抗剂的应用，避免了 GnRHa 在早卵泡期的垂体抑制作用，使内 源性 Gn 水平增高，改善卵巢反应性，提高种植率及临床妊娠率，适用于对 Gn 高反应 和正常反应者，能降低卵巢过度刺激综合征发生的可能，但不适用于对 Gn 低反应者4、 5。目前使用 GnRH 拮抗剂的疗效仍需进一步探讨。1. 2 体外培养和体外胚胎发育潜能的评估1. 2. 1 未成熟卵体外培养(in vitro maturation， IVM)0从 1991 年以来，世界各地的生殖中心陆续开展 IVM 技术。 IVM 是指通过体外培养，使 直径达210 mm窦卵泡内的未成熟卵母细胞发育

8、成为成熟的第二次减数分裂中期(Mil) 卵母细胞，受精分裂成胚胎并移植获得妊娠的技术。IVM可减少乃至避免yao物促排卵 过程，简化IVF方案，缩短治疗时间，因而具有非常明显的优越性，目前IVM的临床妊 娠率可以达到15 %27 %。通过IVM可以促使IVF治疗周期中获得的未成熟卵体外成熟， 增加WF周期的受精率、卵裂率和累积妊娠率；IVM还解决多囊卵巢综合征患者促排卵 后卵巢过度刺激和卵子成熟差以及高龄妇女COH中卵巢反应差或对Gn不敏感妇女促排 卵中的难点7、 8；此外，通过对卵母细胞成熟机理的探讨和研究，可深入了解人类卵 子和胚胎发育机理，为将来从冷冻卵巢组织中获取未成熟卵母细胞进行体外

9、成熟奠定实 验基础，从而实现人类生育能力的储备8。1. 2. 2 胚胎培养系统及发育潜能的评估。体外培养系统的发展： IVF 的培养系统应尽可能创造与母体自然条件相近似的人工环 境，保证卵子在体外生存、受精及生长发育。由于人们对早期胚胎发育的机理仍知之甚少，到现在还没有哪种体外培养系统能完全达到体内自然生理 状态下的培养环境。为了使胚胎在体外顺利生长，克服体外培养中28 细胞阶段的阻 滞现象，人类胚胎的体外培养从单一培养、共培养发展到今天的序贯培养。共培养中采 用动物或人的成体细胞与人胚胎共同培养，由于共培养细胞可能对胚胎产生污染，系统 复杂，并且使用动物细胞时涉及伦理问题，近年已逐渐被专为囊

10、胚培养设计的序贯培养 系统替代。序贯培养注意到体外培养的胚胎在不同发育时期代谢需求的不同，配制出同 系列、不同成分的培养液，依次采用适合该时期胚胎营养需要的培养液进行培养，增加 囊胚的形成率,从而进一步提高胚胎种植率和妊娠率9。胚胎发育与活力的评估：COH可使一个IVF周期中获得多个胚胎，移植具有最高发育 潜能的胚胎可以明显提高IVF的周期妊娠率和胚胎种植率。近年来出现了多种评估胚胎 活力的方法，但最常用的还是通过其形态学进行评估。原核期胚胎形态学的评估内容主 要包括核仁的排列、数量，胞浆晕、核仁核前体和核膜裂解时间。有报道原核形态评估 有助于提高胚胎种植率，在d 3的胚胎评分相似的情况下，原

11、核评分高的胚胎的种植率 明显增高。对于卵裂期胚胎形态学的评估，普遍采用的是对卵裂球数目及形态的评分， 且大多基于在d2或d 3胚胎的卵裂球数目及形态的评估。对胚胎种植率较高的胚胎进 行分析的结果提示，可移植胚胎的特点应为：受精后d 2为45个卵裂球，d 3至少7 个卵裂球，d 2和d 3无多核卵裂球，卵裂球的大小较均匀，胚胎内碎片<20%。胚胎 发育至囊胚期，对囊胚的评估包括的内容有囊胚形成的时间、囊胚形态、扩张程度、内 细胞团和滋养层细胞发育情况等，其中囊胚形成的时间至关重要。在目前常用的人类囊 胚分级系统(scoring system for human blastocysts )中

12、，根据囊胚的发育速度、囊胚腔的大 小和是否孵化、内细胞团和滋养层细胞的情况，将囊胚的发育分为6个时期，根据这个 分级方法， d 5 最好的囊胚评分是 4AA10。2 辅助生殖技术中的冷冻技术生殖医学的冷冻保存技术为精子或卵子的赠送提供极大的方便， IVF 治疗过程中获得过 多的胚胎也可进行冷冻保存，为避免再次取精或取卵手术提供便利。21 胚胎冻融技术。伴随着IVF的发展，胚胎的冷冻与复苏已成为ART中常规技术之一。它的意义在于： 保留IVF周期中多余胚胎，增加了妊娠机会，提高累积妊娠率； 是防治重度卵巢过度刺激综合征发生的强有力的手段； 避免反复超排卵和取卵，减轻了患者的痛苦及经济负担，减少对

13、卵巢的刺激； 胚胎移植困难时胚胎暂时冻存； 接受赠卵后等待赠卵者排除供卵者HIV感染; 胚胎活检后等待诊断结果； 为建立胚胎库提供资源； 为时控性生育选择提供了机会。有报道冷冻胚胎的复苏率可达80%，妊娠率和出生 率分别为 28和 22，胚胎冻融后成功率不受患者年龄、不孕病因、冻存时胚胎发育 的程度等影响。目前国内主要的胚胎冷冻方法是程序化冷冻早期分裂期胚胎，其临床妊娠率欠佳 (16% 50%)，且操作费时、烦琐、需要昂贵的程序化冷冻仪。上世纪80 年代发展起来的玻 璃化冷冻技术具有操作简单、方法简易、快速、无需昂贵的程序化冷冻仪等优点，日益 受到广泛重视。22 卵母细胞冷冻。卵母细胞的冷冻方

14、法目前有两种：一种为成熟卵母细胞 (第二次减数分裂中期， ： metaphaseH, Mil期)冷冻。此时的细胞体积相对较大，具有复杂的细胞内骨架结构和 大量的细胞质，对温度变化很敏感，而且细胞损伤的修复能力很差，因此，在冻融过程 中常发生细胞纺锤体、细胞骨架和透明带的损伤。与胚胎和精子冻存相比，成熟卵母细 胞解冻后的存活率比较低。 ICSI 技术在临床中广泛应用以后，解决了透明带硬化问题， 使冻融后M H期卵母细胞的受精率和妊娠率较前升高。另一种为冻存未成熟卵母细胞冷 冻。此时的卵母细胞体积小，没有减数分裂中期的纺锤体，因此能较好地耐受冻伤；但 是未成熟卵母细胞解冻后核浆成熟的不一致使其解冻

15、后的发育能力普遍较低，仅有约 20%存活的卵母细胞在体外发育到MH期，胚囊形成率更低。23 卵巢组织冷冻。接受放、化疗等治疗的女性患者、单身为了保存生育能力妇女及在治疗前没有足够时间 进行 IVF 以获得冷冻胚胎的已婚患者，可从卵巢组织冷冻移植技术受益。过去十余年的 动物实验已经证实卵巢组织冷冻保存、移植的可行性及其恢复实验动物卵巢功能、生殖 能力的作用。目前，这项技术已进入临床实验阶段。随着第一例人类原位卵巢移植婴儿 的诞生，卵巢组织的冷冻保存及移植已成为人类生殖工程研究领域的热点。常用的获得 卵巢组织的方法有腹腔镜下卵巢切除术和卵巢多点活检术。通过腹腔镜单侧卵巢切除术 可以保存足够数量的始

16、基卵泡，但其外科风险较高，并存在伦理上的争议。目前多倾向 于腹腔镜多点活检术，为了使冷冻保护剂在卵巢组织的中心也能达到理想浓度，必须延 长组织在冷冻保护剂中的平衡时间，但这就使得位于组织表面的细胞有冷冻保护剂中毒 的危险。因此，寻找适合的冷冻保护剂及冷冻保存方案是卵巢冷冻保存成功的关键。目前多采用慢速冷冻、需要时快速解冻的程序冷冻法。玻璃化法冷冻保存人类卵巢组织具有节省冷冻时间和经费的优点，但经 验尚少。3单精子卵细胞浆内注射(ICSI)ICSI 的治疗重点主要是解决男性不育，它的主要适应症有：严重的少、弱、畸精子症， 不可逆的梗阻性无精子症，生精功能障碍(排除遗传缺陷疾病所致)，免疫性不育，精子 功能异常，2次以上不明原因IVFET受精失败或受精率低于30%。在IVM治疗周期和需 用 PCR 方法