《DNA提取及常见问题分析和对策》由会员分享，可在线阅读，更多相关《DNA提取及常见问题分析和对策（25页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、4口DNA提取和常见问题分析及对策主讲人：关镒整理分享j.DN蔺单介绍DN编遗传信息的载体，,1是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象。为了进行测序、杂交和基因的表达，获得高分子量和高纯度的DNAb非常重要的前提。,DNA提取原则*保证DN皓构的完整性纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质排除有机溶剂和金属离子的污染蛋白质、多糖、酚类等降低到最低程度排除其他核酸分子的污染DNA提取的几种方法:、非染色体DNA勺提取ILM.jfLj.质粒DNA勺提取？碱裂解法前尹vtoY?煮沸法线粒体、叶绿体DNA勺提取差速离心结合SD隈解法CTAB(烷基三CTA就原理(植物DN假取经典方法)十六hex
2、adecyltrimethylammoniumbromide,:甲基澳化镂)，是一林阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中(0.7mol/LNaCl)是可溶的,通过有机溶剂抽提、去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇或异丙醇沅淀即可使核酸分离出来。注：CTAB液在低于15c时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15CTAB1流程图裂解液植物材料离心洗涤细胞裂解上层溶液k液氮研磨抽提异丙醇沉淀干燥溶解DN给液CTABP各个组分的作用CTA眼取缓冲液的经典配方ijMTris-HClpH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏;E
3、DT摩合Md+离子或M甲离子，抑制DNase舌性;j*1kNaCl提供一个高盐环境，使DN先分溶解，存在于液相中;CTAIB解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；B疏基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成酶，避免褐变,使酚容易去除。CTA提取缓冲液的改进配方pvp（聚乙烯口比咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DN即酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。除蛋白质:J氯仿/异戊醇抽提（氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离；异戊醇则有助于消除抽提过程中出现的气泡）。使用变性剂变性11（SDS异硫甄酸腹等）高盐洗涤蛋白酶处理除多糖:高盐法：用乙醇沉淀
4、时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5MNaCl,高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯（1/2体积），氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。除酚类物质:4在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂:基乙醇.抗坏血酸.半胱氨酸.加入易与酚类结合的试剂：如PVP醇），它们与酚类有较强的亲和力,B-筑二硫PEG聚乙可防止酚与DNA勺结合除盐离子:HK70%的乙醇洗涤-USB，TE中成分的作用立pH直为TE中的EDT辘螯和Mj+或MH+离子，抑制DNase.0,可防止DNAe生酸解wntlB，Yl|-TvlUz2称取样品，液氮研磨，加入预热的（65C）CTAB及B-琉基乙醇保温1
5、h,期间不停的摇均吸取上清液，移至新的离心管产，加入等体积氯仿：异戊醇（24:1）,轻缓颠倒混匀,10000rpm,10min取上清液，移至新的离也中，加等体积氯仿：异戊醇，颠倒混匀，10000rpm,10min取上清液，加入0.6-0.7V的异丙醇（预冷），后4c/-20C保温沉淀一10000rpm,10min离心取沆淀，70双酹清洗两次，吹干用TE容解DNA然后低温保存材料准备：最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融。液氮研磨：研磨样品时要有液氮的保护，在整个过程中都不要让液氮挥发干净。避免材料回温和反复冻融带来的降解。此外尽&量将样品研磨的很细，这样可以提高DNa细胞裂解：材料
6、应适量，过多会影响裂解，导致DN屋少，纯度低。高温温浴时，定时轻柔振荡。DN航淀：用乙醇或异丙醇都可以。异丙醇沉淀的效率要高于无水乙醇，试验中只需要0.6倍体积的异丙醇沉淀；而需要2倍体1VJcfjiV积的无水乙醇。但是异丙醇沉淀容易将盐成分一起沉淀，且在DN航淀中异丙醇难以挥发除去。DN所燥：晾干DNA让乙醇充分挥发。DN给解：若长期储存建议使用TEg冲液溶解。曷质量的基因组DN型单一无拖DN维度及纯度的检测A260=1双链DNA,A260/280约为1M尾现象约50gg/mL.DNA提取常见问题问题一：DNA品不纯，抑制后续酶解和PC反应原因1. DNAP含有蛋白、多糖、多酚类杂质2. D
7、N的溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应3. DNAP残留有金属离子4. 有rnA勺存留?重新纯化DNA过吸附柱去除蛋白、多糖、多酚等杂质?重新沉淀DNA让酒精充分择技?增加70%乙醇洗涤的次数（2-3次）?力口入RNas掷解RNADNA提取常见问题原XZ1 目料不新鲜或反复冻融2 .未很好抑制内源核酸酶的活性3 .提取过程操作过于剧烈，DN僦机械打断4 .外源核酸酶污染5 .反复冻融1 .尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融2 .液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液3 .在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNAt可增加裂解液中螯合剂的含量，细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔4 .所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌5 .将DN粉装保存于缓冲液中，避免反复冻融DNP提取常见问题问题三：DNA取量少1.2.3.4.实验材料不佳或量少破壁或裂解不充分吸附或沉淀不完全洗涤时DN法失1一尽量选用新鲜（幼嫩）的材料2 .植物要匀浆研磨充分3 .增加吸附的时间，或低温沉淀4 .小心操作
