毕赤酵母发酵手册

《毕赤酵母发酵手册》由会员分享，可在线阅读，更多相关《毕赤酵母发酵手册（8页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、毕赤酵母发酵手册毕赤酵母发酵手册总览简介：毕赤酵母和酿酒酵母很相似，都非常适合发酵生长。毕赤酵母在 有可能提高总体的蛋白质产量的发酵中能够达到非常高的细胞浓度，我们建议只有那些有过发酵经验或者能得到有经验的人的指导的 人参与发酵。因为发酵的类型很多，所以我们很难为您的个人案例提 高详细的过程。下面+s两种基因型的毕赤酵母菌株在15L的台式玻璃 所给出的指导是基于MutMut和发酵罐中发酵而成。请在您的发酵开 始前先阅读操作员手册。下面所给出的表就是整个步骤标题页码1发酵参数12设缶推荐和培养基的制备；23培养中溶氧的测量和使用34种子液的培养45在分批和分批补料培养中生物堂对应于 甘-油的生成

2、4 56，基因型重蛆子在甲醇分批补和MutMut 料状态下表达的介绍6-77细胞的成熟与衰退;88参考文献9-109配方11发酵参数：在整个发酵过程中监测和调控下列参数非常重要。下面的表格描 述了这些参数和参数原因温度(3OnC)在32范以上的温度下生长不利于蛋白质的表达溶20%)毕赤酵母利用甘油和甲醇需要氧气pH (5.0-6.0 和 3.0)对于外源蛋白分泌到培养基中和最适生长非常重要转度) (500-1500rpm使培养基中的氧浓度达到最大值通气（玻璃发酵罐 谟）中为 O.l-LOvvm使培养基中的氧浓度达到最大值取决于容器消泡剂（消除泡沫 的最小量）过多的泡沫会引起分泌蛋白质的降低和罐

3、顶空间的减少碳源变化率）在发酵过程中要.以不同的速率添加不同的碳源淤设备推荐:下面是所推荐设备的清单：发酵罐的夹套需要在发酵过程中给酵母菌降温，尤其是在甲醇流 加过程中。你需要一个固定的来源来提供冷却水（5-10。0。这可能 意味着你需要一个冷冻装置来保持水的;令却。个泡沫探针就像消泡剂一样不可或缺。一个氧气的来源空气（不锈钢的发酵罐需要1-2vvm ）或者 纯氧（玻璃发酵罐需要0.1-0.3vvm ）。添加甘油和甲醇的补料泵。pH的自动控制。培养基的准备：你需要准确配置下列溶液：.发酵所需的基本盐类（第11页）PTM补充盐类（第11页）175ml的50%的甘油每升初始发酵 液，12ml的PT

4、M补充盐每升甘油1740ml的100%的甲醇每升初 始发酵液，12ml的PTM补充盐每升甲醇。1毕赤酵母生长的测定： 在不同的时间点通过测OD600的吸光值和湿细胞的重量来检测毕赤酵 母的生长。培养的代谢速率通过通过观察溶氧浓度对应于有效碳源来 测定。溶氧的测定：简介：溶解氧的浓度时指氧气在培养基中的相关比例，溶氧100%是指 培养基中氧达到饱和。毕赤酵母的生长需要消耗氧气，减少溶解氧的 满度。毕赤酵母在生长时会消耗氧气，减少溶氧的程度。然而，因为 代谢甲醇的最初阶段需要氧气，所以将溶氧浓度维持在一个适当的水 平（20%）来确保毕赤酵母在甲醇上的生长就至关重要。准确测定 和监测培养中的溶氧浓度

5、将会为您提供关于培养状态和健康程度之类 的重要信息。因此，精确校正您的发酵设备非常重要，请查阅您的操 作手册。溶氧浓度的维持：1、很难依靠发酵罐的氧气转换速率（OTR ）将溶氧浓度维持在 20%,特别是在小型的玻璃罐中。在玻璃发酵罐中，通气一般约为 0.1-0.3vvm （ 1L发酵液每分钟1L氧气）来提供氧气使DO保持在 20%。氧气消耗的变化依赖于所添加的甲醇的总量和蛋白质的表达。2、在通气为0.1-0.3vvm时，氧气可达到足够的水平，这在许多 玻璃发酵罐中可以通过通入无菌空气来实现。在不锈钢发酵罐中，压 力可增加OTR（与Ka L有关）。3、如果一个发酵罐不能提供足够水平的氧气，甲醇的

6、添加需要因 此适当降低。请注意降低甲醇的总量可能导致蛋白质表达水平的降低。4、为了使蛋白质表达水平达到最大，发酵时间应被分割来以较低 的流加速度添加相似水平的甲醇。对许多重组蛋白质来说，可以观察 到甲醇消耗的总量和蛋白质产生的总量有直接的关系。DO测量的用处：在毕赤酵母生长阶段，消耗氧气而使DO浓度维持在较低水平。 请注意不管是在甘油或甲醇中生长，都要消耗氧气。DO浓度可用来衡 量代谢速率和碳源是否受抑制，代谢速率则是培养健康程度的一个指 标。如果你希望能够完全的诱导AOX1启动子，确定碳源是否受抑制 就非常重要。例如：DO浓度的改变可让你确定是否在添加甲醇前所有 的甘油都已耗尽，其次还可以确

7、定甲醇流加的速率是否超过消耗的速 率。过多的甲醇（1-2%vvm ）可能会产生毒害。DO的调控：如果碳源受到抑制，关闭碳源的添加将会导致培养理工甲醇的速 率降低，DO值会上升。终止碳源的添加，观察在碳源的流加关闭后需 要多长时间来使DO值上升10%。如果延迟时间很短（1min），说 明碳源受抑制。发酵的准备和甘油批式发酵发酵种子液的摇瓶培养：记住不要向摇瓶中加入太多的培养基，培养基体积应该在摇瓶总 体积的10-30%左右。1、摇瓶中包含约为初始发酵液体积5-10%的从MD或MGY平 板上的一个菌落或者冷冻甘油储藏液中接种的MGY或BMGY。2、摇瓶应该30C, 250-300rpm的摇床上培养

8、16-24h直到 OD=2-6。600 为了精确的测量OD 1.0，在读数前将样液稀释10倍。600甘油批式发 酵：1、将发酵罐和包含4%甘油的发酵基础盐类培养基灭菌。2、在灭菌和冷却后，待温度降至30C时，开启搅拌和通气至操 作环境（通常为最大转速和0.1-1.0vvm ）并用28%的氨水（未稀释） 将培养基的pH调整到5.0。每升培养基中加入4.35ml无菌的PTM1 基础盐类。3、从种子液摇瓶中接种初试发酵体积5-10%的种子液到发酵罐 内。请注意在培养开始先DO值接近于100%。当开始培养后会消耗 氧气，导致DO值下降。请添加所需氧气以确保DO值超过20%。4、进行批式发酵直到甘油被完

9、全消耗（18-24h ），标志是DO 值增加到100%。请注意甘油完全消耗的时间会随着初试发酵液密度 而变化。5、每个发酵阶段的完成都需要进行取样，并且每天至少两次。每 个时间点取10ml样品，并从10ml中另取出1ml样品。样品用于分 析细胞的生长（OD600和细胞湿重），pH,显微观察，蛋白质的浓 度或活性。将菌体和上清（离心后）在-80C下保藏，用于后面的分析。 再进行第5页的甘油补料培养。产量.9-=!=- 这个阶段所期望达到的细胞产量为90-150g/L湿细胞。重组蛋白 质由于缺乏甲醇的诱导而不会产生。甘油补料培养介绍：一旦所有的甘油在批式发酵培养中耗尽，甘油的补料需要马上开 始来在

10、限制条件下增加细胞生物量。当你准备进行甲醇诱导时，你需 要通过DO值来确定甘油已耗尽。甘油补料培养：1、加入50%w/v的每升含12mlPTM1的甘油进行补料。将补料 速率设为18.15ml每小时每升初试发酵液体积。2、甘油补料将进行约4h或更长。在本阶段完成后细胞产量应达 到180-220g/L湿细胞但是不会有重组蛋白质的产生。注意：蛋白质的表达水平依赖于在甘油补料培养中所产生的细胞量。补 料持续时间将会变化来使蛋白质的产量达到最优，建议的大致的范围 为50-300g/L湿细胞。4%甘油的是所建议的在补料中的最大水平， 更高的甘油浓度将会产生毒害问题。重要：如果溶氧低于20%,应该停止甘油或

11、甲醇的补料并且不做任何提 高溶氧的事直到溶氧稳定。这时开始调整搅拌、通气、压力或氧气的 补充。蛋白酶：在文献中，有报道称如果培养基的pH低于3.0，中性蛋白酶会被 抑制。如果你认为中性蛋白酶降低了你的蛋白质的产量，在甘油补料 培养中或者在甲醇诱导的开始阶段将pH控制设定点改为3.0并且允许 培养的代谢活动在低于3.0的pH条件下进行4-5h ( Brierley , et al., 1994 ; Siegel , et al. , 1990 )。甲醇补料培养简介：在甲醇补料来充分诱导AOX1启动子前左右的甘油都必须消耗干 净。然而，有报道称甘油和甲醇的混合补料已经成功的表达了重组蛋白质(Bre

12、erley , et al. , 1990 ; Sreekrishna , et al. , 1989 )。慢慢的流 加甲醇来使培养适应在甲醇中生长非常重要。如果甲醇加德太快将会杀死细胞。一旦培养物适应了 甲醇，用DO值来分析培养的状态并且来确定甲醇流加的时间点来使 蛋白质的表达达到最优。在甲醇上生长液会产生大量热量。所以这个 阶段温度的控制非常重要。+型菌株的甲醇补料培养：Mut1、终止甘油的补料并且开始用含12mlPTM1基本盐类每升的 100%的甲醇进行诱导。设定补料速率为3.6ml/h每升初试发酵液体积。2、在开始的2-3h内甲醇会在发酵液中累积，培养物适应甲醇的 过程中溶氧值会有变化

13、。3、如果DO值不能维持在20%以上，停止流加甲醇，等到DO值 稳定后继续以当前速率流加甲醇。增加搅拌、通气、压力或者氧气的 补充来使DO维持在20%以上。4、当培养物完全适应利用甲醇（2-4h）并且甲醇成为其限制性 生长因子后，将会有一个稳定的DO读数和一个较快的DO稳定时间点（通常不 到1min ）。在培养物适应甲醇后而将流加速率翻倍前在限制条件下保 持这个较低的流加速率最少1h。然后流加速率增加一倍到约7.3ml/h每升初始发酵液体积。5、在以7.3ml/h/L的速率流加2h后，增大甲醇流加速率到10.9 ml/h每升初始发酵液体积。这个流加速率贯穿剩余发酵过程。6、整个甲醇补料培养一共

14、加入接近740ml每升发酵液初始体积， 持续差不多70h。然而，这个针对不同的蛋白质可能会有一些变化。产量：在甲醇补料培养中细胞浓度会最终增加到350-450g/L湿细胞。记住这些因为大多数的发酵都在进行补料培养模式，最终的发酵体积会接近于2 倍初始发酵体积。s型毕赤酵母菌株的发酵：Muts型培养物代谢甲醇不充分，他们的氧气消耗就非常低。因此，你 Mut因为s型菌株的标准发酵中，调整甲醇流加速率MutDO值来估量培养。 在不能利用来保持培养基中的不超过0.3%（可以由气象色谱分析来确 定）的过量甲醇。当s Mut气象色谱分析确保甲醇维持在无毒害水平，我们在有经验的指导 下来进行s型重组菌株的生

15、长型菌株的蛋白质的表达。气象色谱分析对 于分析和优化Mut非常有帮助。甲醇补料培养，接上s型菌株的甲醇补料培养：Mut s+型菌株所Mut型菌株的甘油批式培养和甘油补料培养这两 个阶段按照Mut+s型在甲醇诱导阶段的区别主要是方法和培养过程中 型和描述的发酵。MutMut甲醇流加的总量。1、在开始阶段流以1ml/h每升初始发酵液体积的速率流加每升含 12mlPTM1基础盐类的甲醇2h。然后每30min增加10%直到3ml/h 的速率，以此速率保持整个发酵过程。2、发酵在甲醇诱导约100h后放罐。时间可能因蛋白质表达的优 化而变化。细胞的成熟与衰退：简介：方法和设备不完全的列在下面。细胞的总量或上清液的体积将会 决定你需要哪种设备。收获细胞和上清液：在小型发酵罐（1-10L ）中，培养物可以被手机到离心管（500- 1000ml）中，再到离心管中将细胞从上清液中分离出来。在大型发酵罐中，大型的膜过滤单元（微孔）或Sharples离心机 可用于将细胞从上清液中分离出来。最合适的方法依赖于你需要细胞 还是上清液作为你想要表达的