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1、酶和蛋白质提取消过毒的打孔器进行伤口处理后，在每个伤口处添加50yL以下处理(1)无菌水，对照; (2 )浓度为 lOOOpg/mlGAg( 3)浓度为 1 xl04 spores/mlP. expansum 孢子悬浮液；( 4)浓 度为1000g/mlGA3+浓度为1 x104 spores/mlP. expansum抱子悬浮液。处理后湿纱布覆盖并 用PE塑料膜密封作保湿处理。贮藏于常温(20-25)下。分别在0、12、24、36和48小时取样进行测定酶活性。取样时沿伤口用刀小心切下1g果实组织，加入10 mL冷(4)的 50 mmol/L磷酸缓冲液(PBS )内含1.33 mmol/L E
2、DTA和1% PVPP缓冲液(pH 7.8)。研钵加 入少量液氮预冷后，在冰浴中碾磨，破碎组织，然后在冷冻离心机12000rpm离心15分钟。 取上清液供酶活性和蛋白质含量用。蛋白质含量测定试验材料和试剂：牛血清白蛋白标准溶液:准确称取100mg牛血清白蛋白，溶于 100mL蒸 馏水中”即为1 000帼/ mL的原液。8.1.2蛋白试剂考马斯亮蓝G-250 :称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90%乙醇中， 加入85%(W/V )的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1 000mL。8.1.3 乙醇；磷酸( 85%)。试验方法：分别取牛血清白蛋白标准溶液(1000g/mL)0,、1
3、0咽、20皿、40咽、60皿、 80皿100咽，无菌水补至100皿，加入考马斯亮蓝G-250试剂5mL，作为标准溶液；分别取标准溶液和上清液(试验7中得到)400 “L加到酶标板，以无菌水置零，测定OD595；酶活的测定9.1 试验材料和试剂9.1.1 氮蓝四唑；甲硫氨酸；核黄素；过氧化氢；愈创木酚；邻苯二酚。9.1.2 Na HPO -12H O；NaH PO -2H O。2 4 2 2 4 29.1.3磷酸缓冲液PBS酉己制母液：0.2M NaHPO :称取 71.6g NaHPO-12H O，溶于 1000ml 水；2 4 2 4 20.2M NaH2PO4 :称取 31.2g NaH2
4、PO4-2H2O，溶于 1000ml 水。按表2配制0.2M的PB ( mL ),最后稀释至所要的浓度表 1 不同 pH 值 PBS 的配制pH0.2M NaHPO(mL)240.2M NaHPO(mL)246.426.573.57.062387.891.58.59.2 试验仪器9.3.1 200yL、lOOOyL 移液枪，eppendorf ；9.2.2 酶标仪，；9.2.3 酶标板， JET BIOFIL9.3 试验方法9.3.1超氧物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD )活性的测定SOD 采用氮蓝四唑(nitro-blue tetrazolium，NBT )法(B
5、eauchamp 和 Fridovich，1971)。反应步骤为：取200卩1粗提液，加入3.7 ml NBT反应液50mmol/LpH7.8的磷酸缓冲液（PBS ）配制的含77.12卩mol/L氮蓝四唑,100卩mol/LEDTA - Na和13.37mmol/L甲硫氨酸2溶液L在30下保温2分钟后加入100卩1核黄素溶液（PH7.8的50mmol/L磷酸缓冲液中含 80.2卩mol/L核黄素和100卩mol/LEDTA - Na2 ），在 4000Lx日光下反应20min。然后迅速测定 A560。以不照光的管做空白。用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400此。酶活 性按以下公式计算
6、：以抑制NBT光化还原的50%为一个SOD活性单位，结果以U/mg蛋白 表示。以加缓冲液代替酶液的作为对照。SOD 总活性二（A k - AxV/（A k x0.5xWxV）ck Eckt式中，A为照光对照管的吸光度；A为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml）； Vt ckE为测定时样品用量（ml） ； W为样品鲜重（g ）或蛋白质含量（mg ）。9.3.2过氧化氢酶（Catalase , CAT ）活性测定CAT活性参照Aebi（1984）7啲方法进行测定。用酶标仪进行测定时按比例调整为总反 应体积为 400gL。400 此反应液含 50 mmol/L 的 PBS （pH 7.0） , 3
7、0 mmol/L 的 H O 和 50 卩L 22粗酶液。反应从加入过氧化氢开始计时，连续测定在240 nm吸光度的降低值。酶活性定义 为：一个过氧化氢酶单位相当于在规定条件下于温度25C , pH7.0条件下1分钟分解lgmol 过氧化氢所需酶量，结果以U/mg蛋白或U/g鲜重表示。9.3.4多酚氧化酶（Polyphenoloxidase, PPO ）活性的测定PPO活性测定采用邻苯二酚法（Aquino-Bolanos和Mercado-Silva , 2004 ） 8o用酶标 仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400卩L。350卩L反应液（用50mmol/L , pH6.4的 PBS配制内
8、含100卩mol/L邻苯二酚中加入50 gL的粗酶液平衡1分钟后连续测定398nm 吸光度的变化。以1分钟内398nm吸光度上升0.01为一个酶活性单位，结果以U/mg蛋白 或U/g鲜重表示。9.3.5过氧化物酶（Peroxidase , POD ）活性测定POD活性测定采用愈创木酚法（Lurie等，1997）9。用酶标仪进行测定时按比例调整 为总反应体积为400此。反应体系为30此粗酶液，290卩L 0.3%愈创木酚（用50 mmol/L的 PBS 配制，pH 6.4 ）和 80卩L0.3%H2O2 （用 50 mmol/L 的 PBS 配制，pH 6.4 ）。反应在加入 H2O2后开始准确
9、记时。连续吸光度在470 nm的上升值。酶活性以每分钟上升0.01为一个 单位，结果以U/mg蛋白或U/g鲜重表示。体系二SA对苹果果实抗性相关酶活性的影响用消过毒的打孔器在每个果实表面形成统一大小和深度的伤口。每个伤口处等量（30卩1） 加入（1 ） SA溶液（lOyg/m1） ； （ 2 ）酵母悬浮液（108 cells/ml）；（ 3）用5人溶液（10yg/m1） 配制的酵母悬浮液（108 cells/ml）；（ 4）无菌水（作为对照）。处理后贮藏于常温（20 C）， 并用PE塑料膜密封作保湿处理。定期取样对组织酶活性和蛋白质含量进行测定。取样时先 用无菌刀片表皮组织，然后用打孔器分别在
10、伤口处和离开伤口组织5mm位点取样。每个处 理重复3次，每个重复6个果实。整个实验重复2次。2.7.3 SA对梨果实POD活性影响完好的果实在SA（ 100 yg/ml）溶液中浸泡10分钟后贮藏于常温（20 C ）,然后定期取 样对组织POD活性进行测定。以无菌水处理的为对照。提取时先用刀片削去表皮组织。每个 处理重复3次，每个重复6个果实。整个实验重复2次。2.7.4 酶提取和测定的程序1克果实组织加入10 ml冷（4C）的50 mmol l-1磷酸缓冲液:PBS内含1.33 mmol l-1 EDTA 和1% PVPP缓冲液（pH 7.8）。加入少量石英砂在冰浴中碾磨，破碎组织，然后在冷冻
11、离心机 12000rpm离心 15分钟。取上清液供酶活性和蛋白质含量用。蛋白质含量按Bradford（ 1976） 的方法进行。2.7.5超氧物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD ）活性的测定SOD 采用氮蓝四唑（nitro-blue tetrazolium，NBT ）法（Beauchamp 和 Fridovich，1971）。 反应步骤为取200卩1粗提液 加入3.7 ml NBT反应液50mmol/l pH7.8的磷酸缓冲液（PBS） 配制的含77.12卩mol/1氮蓝四唑，100ymo1/1 EDTA-Na?和13.37mmol/l甲硫氨酸溶液，在 30C下保温2
12、分钟后加入100卩1核黄素溶液（pH7.8的50mmol/l磷酸缓冲液中含80.2卩mol/L 核黄素和100gmo1/1EDTA-Na ），在4000Lx日光下反应20min。然后迅速测定A。以不2560照光的管做空白。（用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400卩1，下同）酶活性 按以下公式计算：以抑制NBT光化还原的50%为一个SOD活性单位，结果以U/mg蛋白表 示。以加缓冲液代替酶液的作为对照。SOD 总活性二（A k - AxV/（A k x0.5xWxV）ck Eckt式中，A为照光对照管的吸光度；A为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml）； ckEVt为测定时样品用量（
13、ml） ； W为样品鲜重（g ）或蛋白质含量（mg ）。2.7.6过氧化氢酶（Catalase , CAT）活性测定CAT活性参照Aebi （1984）的方法进行测定。3ml反应液含50 mmol/l的PBS （pH 7.0）, 30 mmol/l的H2O2和50卩l粗酶液。反应从加入过氧化氢开始计时，连续测定在240 nm吸光 度的降低值。酶活性定义为：一个过氧化氢酶单位相当于在规定条件下于温度25C , pH7.0条件下1分钟分解1gmo1过氧化氢所需酶量，结果以U/mg蛋白表示。版浪m哩uvnMEK坡 、list f 。芒职来密2导舀骰疑竦熾胆曲01 趣-。悭契亘002 吕廿(OZ Hd
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