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1、1=1【实验目的】学习和掌握常用基因组DNA提取方法。【实验要求】1.设计所采用实验方案并独立完成所有实验操作； 2.获得高纯度、完整 DNA 样品。一、原理：利用含高浓度SDS的抽提缓冲液在较高温度（5565C ）条件下裂解植物细胞，使 染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸，然后提高盐浓度KAc）和降低温度（冰上保温） 的办法沉淀除去蛋白质和多糖（在低温条件下KAc与蛋白质及多糖结合成不溶物），离 心除去沉淀后，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。二、药品试剂及耗材： 液氮 提取缓冲液：500 mmol/L NaCl, 100 mmol/L Tris-HCl p
2、h8, 50 mmol/L EDTA p，h810 mmol/L 2-巯基乙醇（用前加入） 20% SDS ph7.2 5 mol/L KAc 氯仿：异戊醇（24：1） 异丙醇 70%乙醇TE 缓冲液:10 mmol/L Tris-HCl,l mmol/L EDTA,PH8.0耗材：移液枪，15、2.0、1.5ml离心管，篮、黄、白枪头各四套离心管架4个，离心管盒2个，水浴泡沫8个，研钵及小药勺8套 棉手套，薄膜手套，透明胶布，剪刀三、操作程序1. 将1_g植物材料于液氮速冻，然后在研钵中将其磨碎，将粉末转至2 ml离心管中。2. 加入1.2 ml预热至65C的提取缓冲液（3V），轻缓振荡混匀
3、，加入120 ul 20%SDS（达到终浓度 2%），混匀，置65C水浴中放置30分钟，不时颠倒混匀。3. 加入0.45 ml 5M的醋酸钾（1/10V），混匀，冰浴20分钟，在10000 rpm离心20 min。需要的 话，Miracloth纱布过滤除去沉淀，取上清液转入另一离心管中。4. 加入等体积氯仿：异戊醇（24： 1）,轻轻颠倒混匀，12000 rpm离心15 min。5. 转移上清液到另一新离心管中，加入冰预冷异丙醇，轻轻颠倒混匀，（见丝状沉淀）-20C 放置30分钟沉淀核酸。6. 25 C， 12000 rpm，离心 10 min，收集沉淀。7. 弃上清，70乙醇洗两次。& 凉干
4、DNA,溶于50 M ddH2O （或TE biffer）, 4C保存备用。各药剂作用： 平衡酚（Tris饱和）：用Tris碱饱和的苯酚，其作用是去除蛋白质有机合成的中间体；重提缓冲液： 10mmol/L Tris-HCl（pH8.0）0.1mol/L EDTA （ pH8.0）螯合溶液中的金属离子（Ca2+ ；0.5%SDS阴离子表面活性剂；氯仿：抑制核酸酶，提苯酚； 异戊醇：异戊醇可快速分层，去气泡； 异丙醇：能与自由水紧密结合。结合了溶解 DNA 的水分子，使 DNA 沉淀。可常温沉淀，离心，加入 体积为0.50.7V，但，不易除去，故用70%酒精多洗几次，否则对酶切，连接有影响。无水乙
5、醇：易于从DNA沉淀中除去。但-20C放置1030min,离心T 4C,加入沉淀剂体积大（2倍）， 由于使用的管多为一次性，故浪费。蛋白酶K （Proteinase K）：无RNA酶和DNA酶活性，有降解天然蛋白质的能力； RNA 酶：分解 RNA。要点1：某些植物种的 DNA 由于褐色多酚类化合物的存在会出现变色现象，这种变色通常不会影响后 续的实验操作。但如果发现有影响的话，可以在一定量的 2-巯基乙醇，防止酚氧化，对 DNA 有一定 稳定作用。或在提取缓冲液中加入2% （W/V）的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）,与酚类结合，有助于除去多 酚类杂质。要点2：将SDS溶液加入到化冻的提取物中时，可能会有沉淀析出，要保证析出的SDS重新溶解，以 及65 C保温时提取物混匀。要点3：在高浓度（lmol/L）的钾离子存在的情况下，十二烷基磺酸钠（SDS）会与蛋白或多糖结合变 成不溶性的十二烷磺酸钾复合物, 这类复合物通常呈絮状, 必须要经较高转速离心和 Miracloth 纱布 过滤予以去除.要点4：若沉淀难于重新溶解,可在65C加热10min.
