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1、前言:如何利用LC-MS/MS,更快更好的建立生物样品分析 方法？以前曾在实验室的seminar上，做过一次关于如何建立生物样品分析方法的工作报告。时隔两年，恰逢仪器信息网举办第一届网络原创作品大奖赛，在这里将这几年来对于生物样品分析的一点点感受总结一下，与大家交流、分享。首先明确一下文中提到的“生物基质”，主要指的是血浆、血清、唾液、尿液或者器官组织等。 药物透过机体的各种生理屏障，进入到这些基质中，就是我们所说的生物样品” （Biosample）。生物样品中的药物浓度极低，我们如何利用灵敏度高的仪器如LC-MS/MS， 更好的建立测定生物样品中药物浓度的分析方法呢？下面我主要从以下四个方面
2、进行阐述:一、色谱-质谱条件的确立1、质谱条件的确立当使用液质联用仪对某一个化合物进行定量分析时，我们就需要建立一个质谱分析方法。虽 然仪器的型号不尽相同，但原理却是一致的，基本原理如图所示。我们在确定方法时，主要 考虑以下几个因素：（1）化合物的性质:包括化合物的结构、化合物的极性及化合物的pKa值。首先了解化合 物的结构，我们可以大概的推断其碎片离子的断裂方式，选择较为稳定的碎片离子作为定量 反应的子离子，也可以根据经验判断选用哪种source更为合适；根据化合物的极性大小， 我们可以选择一种或几种恰当的溶剂作为溶媒，既能保证完全将样品溶解，又能提高化合物 的质谱响应；而清楚化合物的pKa
3、值，有助于我们选择流动相的添加剂及其pH值，从而提高质谱响应。（2）流动相添加剂的选择:在液相紫外检测中，我们使用的添加剂的种类繁多，可以是挥 发性的酸或者碱（如甲酸、乙酸和氨水等），也可以是不易挥发的缓冲盐（如磷酸二氢钠- 磷酸缓冲液、磷酸二氢钾-磷酸缓冲盐）。但是在液质分析中，基于质谱检测的原理，我们 只能使用可挥发的酸碱或缓冲盐，那么种类就会受到极大的限制。在日常分析中使用到的添 加剂主要有甲酸、乙酸、三氟乙酸、氨水和甲酸铵、乙酸铵等缓冲盐，见图一。三乙胺在紫 外检测中，常作为扫尾剂，但是在液质检测中是绝对禁止的。因为三乙胺进入质谱后不易清 除，残留及其严重，能够抑制离子的响应。一旦三乙
4、胺用量增加，时间延长，那么慢慢地质谱就不能灵敏的检测化合物了，所以这点大家要注意，尤其对于液质的初期使用者。图一液质分析中推荐使用的流动相和添加剂推荐使用不推荐使用，尽乾不使用存机潜剂jz+n：乙席.二氧甲焜 正札叫t 瓠化曜甲部、乙神、昇丙醉、己靛苇，环己焜.H雌冲波乙般桢、甲浏S酸碗荚他乙酸.甲酸.:#，乙愤正尚r ）埔酸，商氯酸.嬉酸、借酸.横彼 季胺-做碰、三匕肢掐洁制、表面沃牲削沮j-对轼剂、dick*aiHR2CG8.3）质谱离子源的选择:质谱出现早期，主要有电子轰击源（EI）、化学电离源（CI）、电 喷雾电离源（ESI）和大气压化学电离源（APCI）。但随着科学技术的进步，源的发
5、展也是 日新月异。目前，用于定量的离子源主要是电喷雾电离源（ESI）和大气压化学电离源（APCI），他们的使用范围如图二所示。图二12341010101010MALDIa LG -4*cc oCLGCGCLC MALDIVolatilityESI源是液相离子化，主要用于分析极性比较大的化合物及大分子化合物；而APCI源是气 相离子化，主要用于分析极性较小的小分子化合物。在掌握以上基本信息后，根据各个型号仪器的标准操作规程(SOP)进行操作，对各个参 数进行优化，从而确定质谱分析方法。2、色谱条件的建立在液相色谱紫外检测中，要求化合物之间的分离必须达到完全分离，即R1.5，如果进行 定量，那R最
6、好沱2.0，这就给分析工作者提出了很高的要求一一准确的配制流动相，精确 的调好流动相的pH及添加剂的浓度。但在液质分析中，我们经常使用多反应监测(MRM/SRM)对化合物进行定量，由于MRM要求选择两次离子，因此它具有很高的专属 性，基于这点我们对多个化合物同时进行检测时，不需要彼此间达到完全分离就可以对他们 进行定量分析。但这里需要强调的一点是，由于生物样品中含有大量的基质，这些基质的存 在会严重的干扰和影响化合物的测定，因而我们需要利用色谱将化合物与基质分开，从而降 低基质效应的影响，即降低离子抑制。二、内标的选择检测时使用内标物的目的是消除操作误差，因此我们在进行生物样品分析时必须选择一
7、个合 适的化合物作为内标物。LC/MS/MS法的高专属性使其对内标物与待测物的色谱分离要求 不高，但要求内标物色谱行为及提取回收率，尤其是质谱信号响应与待测物的接近；要求在 测定过程中内标物受系统误差及碰撞压力变化的影响与待测物一致。所以理想的内标物应为 待测组分的同位素标记物，但由于同位素标记物价格非常昂贵且不易获得，我们尝试选用结 构相似的化合物（或者同系物）作为内标物。三、样品预处理方法的选择根据前人的经验，我们在生物样品预处理中，经常使用到的方法主要有以下三种一一沉淀蛋 白法（PPT）、液液提取法（LLE）和固相萃取法（SPE），而这三种方法的选择，主要取 决于化合物的特性。分析极性比
8、较大的化合物，优先考虑使用沉淀蛋白法，这种方法操作简单，省时省力；缺点 是生物基质中内源性物质去除的不彻底，基质效应较大，使得方法灵敏度不高。分析极性较小的化合物，我们可以选择液液萃取法，这种方法根据相似相溶的原则进行分离 提取，优点在于处理完的样品较干净，内源性物质去除彻底；缺点在于消耗有机试剂的量很 大，对操作人员、环境的污染也大。固相萃取法，在国外使用尤为广泛。它采用固相萃取小柱作（见图三）为分离媒介，小柱中 添加了不同填料的固定相，如以键合硅胶为基质的如C18、NH2、COOH、PSA、SAX等， 是硅胶的表面活性大为降低，最大程度的降低了极性化合物的不可吸附和拖尾，使样品回收 率和重现性得到保障；以高分子聚合物为基质的如PEP、HXN、PAX、PCX等，具有高纯 度、高比表面的特点；以吸附型填料为固定相的如硅酸镁、氧化铝等，主要通过表面的极性 吸附达到分离的目的。因此，固相萃取法适用于各种极性的化合物，样品处理过程中使用的 设备（见图四）简单，柱子活化便捷，基质效应低；缺点是价格昂贵，不太适合我国目前的 国情。近年来又出现了 96孔板的固相萃取小柱，可以批量处理样品，耗材少，耗时短，大 大提高了工作效率。图三-1
