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1、限制性核酸内切酶的命名和类型第二章基因工程的酶学基础第一节限制性内切酶第二节 DNA 连接酶第三节 DNA 聚合酶和反转录酶第四节 DNA 修饰酶第五节外 切核酸酶第六节单链内切核酸酶第七节RNA酶核酸酶：通过切割相 邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键从而导致核酸分子多核酸链 发生水解断裂的蛋白酶。基本概念及其生物功能特异水解断裂 RNA 分子核糖核酸酶 (RNase)特异水解断裂DNA分子脱氧核糖核酸酶(DNase)非专一 性酶底物或者为 DNA 或者为 RNA 从核酸分子末端逐个降解核苷酸 叫外切核酸酶从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段 叫内切核酸酶按水解断裂核酸分子的方式 :
2、根据作用的核酸底物不 同:*基因工程的操作是在分子水平上的操作是依赖一些酶 (如限制 性核酸内切酶连接酶 DNA 聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割 拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为“工具酶”。工具酶、限制修饰系统、限制性核酸内切酶的命名和类型、II型 限制性核酸内切酶的基本特性、影响限制性内切酶活性的因素、限制 性内切酶对DNA的消化作用第一节限制性核酸内切酶限制性内切核 酸酶(Restrictionendonuclease)是一类能够识别双链DNA分子中的某 种特定核苷酸序列(bp)并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。限制性核酸内切酶概念性质内切酶主要来源于原核生物即在核酸 分子链的
3、内部制造切口的酶。形成P和OH末端自我保护作用功能细菌的限制和修饰系统 (RM 体系)来源任何一种生物体都存在防御外界物质进入的机制大 肠杆菌B大肠杆菌Kphage入(B)EOP=邙限制作用)EOP=邙限制作用) EOP=(修饰作用)修饰的phage入(K)人们发现侵染大肠杆菌的噬菌 体都存在着一些功能性障碍。即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称(RM体系)。细菌的 RM 体系类似于免疫系统能辨别自身的 DNA 与外来的 DNA 并能使后者降解掉。寄主的限制与修饰现象EOP成斑率efficiencyofplatingEOP=限制 性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA进行分解切成小片断。()限制(
4、Restriction )限制作用:实际就是限制性内切酶降解外 源 DNA 维护宿主遗传稳定的保护机制。细菌自身的 DNA 碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护不能被自身 的限制性内切酶识别切割。() 修 饰 ( Modification ) Dam 甲 基 化 酶(DNAAdenineMethylase)GATC腺嘌吟N位置引入甲基Dcm甲基化 酶(DNAcytosineMethylase)CCAGG 或 CCTGG 序列在第二个 C 上 C 位置上引入甲基修饰作用:宿主细胞通过甲基化作用达到识别自身遗 传物质和外来遗传物质的目的。()限制与修饰系统相关的三个基因hsdR:编码限制性内切酶 hsd
5、M:编码限制性甲基化酶hsdS:编码限制性内切酶和甲基化酶的 协同表达这类酶能识别 DNA 分子上的特定位点并将双链 DNA 切断 这类酶使DNA分子特定位点上的碱基甲基化即起修饰DNA的作用。作用是协同上述两种酶识别特殊的作用位点。入噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞K株B株中）宿主细胞甲 基化酶将染色体 DNA 和噬菌体 DNA 特异性保护）封闭自身所产生 的核酸内切酶的识别位点（修饰）大肠杆菌宿主细胞 K 株 B 株有各 自的限制和修饰系统。限制和修饰作用的分子机制外来 DNA 入侵时遭到宿主限制性内 切酶的特异降解邙限制）由于降解不完全外来少数DNA分子在宿主 细胞中繁殖过程中被宿主细胞
6、的甲基化酶修饰虽然是外来却不被降 解。接受了新宿主菌甲基化修饰的同时丧失了原宿主菌修饰的标记 丧失在原宿主细胞中的存活能力。基因工程中应采用缺少限制作用的菌株作为受体。、限制修饰系统、限制性核酸内切酶的命名和类型、II型限制性 核酸内切酶的基本特性、影响限制性内切酶活性的因素、限制性内切 酶对 DNA 的消化作用第一节限制性核酸内切酶年 HOSmith 和 DNathans 提议的命名系统命名原则如下：限制性内切酶的命名用属 名的第一个字母和种名的头两个字母组成个字母的略语表示寄主菌 的物种名组成酶的基本名称。大 肠 杆 菌 （ Escherichiacoli ） 用 Eco 表 示 流 感
7、嗜 血 菌 （Haemophilusinfluenzae）用Hin表示如果酶存在于一种特殊的菌株 中则将该菌株名的第一个字母加在基本名称后若酶的编码基因位于 噬菌体（病毒）或质粒上则用一个大写字母表示此染色体外遗传成分。如HindII： d菌株EcoRI:抗药性R质粒如果一种特殊的菌株内 有几种不同的限制与修复系统用罗马字母表示该菌株中发现某种酶 的先后次序。如HindII： d菌株中发现的第二个酶所有的限制酶除以上名称外 还要冠以系统名称。限制性内切酶的系统命名为R甲基化酶为M。如RHindlll表示限制性内切酶MHindlll表示相应的甲基化酶实际 应用中R常被省略。EcoRIEscher
8、ichia属名Coli种名Ry株系编号若种名头个字母相同 则其中一个可用种名的第一和第三个字母。目前鉴定出四种不同类型的限制性内切酶。据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰 酶活性可分为I、II、III、W型。限制性内切酶的类型二、限制性内切酶的类型据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修 饰酶活性可分为I、II、III、W型。基因工程中使用注：SAM为S 腺苷甲硫氨酸主要特性I型II型 III型限制修饰蛋白结构辅助因子识别序列切割位点双功能（具甲基 化）异源三聚体ATPMgSAM距识别序列kb处随机性切割单一功能 同源二聚体Mgbp回文序列识别序列内或附近特异
9、切割双功能（具甲 基化）异源二聚体ATPMg距识别序列下游bp处随机性切割首先由 MMeselson和RYuan在年从大肠杆菌B株和K株分离的。（）识别位点序列 EcoB： TGA（N）TGCTEcoK： AAC（N）GTGC I 型限制性内切酶的基本特性如EcoB和EcoKo未甲基化修饰的特异序列。N：表示任何一种核苷酸需ATP、Mg和SAM （S腺苷甲硫氨酸） （）辅助因子在距离特异性识别位点约bp处随机切开一条单链不产 生特异片断应用不大 Recognizesitecutkb （）切割位点首先由HOSmith和KWWilcox在年从流感嗜血菌中分离出来。分离的第一个酶是HindII未甲基
10、化修饰的双链DNA上的特殊 靶序列（多数是回文序列）与DNA的来源无关。A B N BAABNB A或II型限制性内切酶的基本特性（） 识别位点序列识别位点处。切开双链DNAo形成粘性末端（stickyend）或平齐末端（bluntend）。女口：（）切割位点 EcoRI G AATTC CTTAA G PstI CTGCAG GACGTC产生粘性末端 EcoRV GAT ATC CTATAG产生平齐末端 AAGCTTTTCGAAABCDDNADNAHindlll Hindlll切割位点核酸内切酶Hindlll对双链DNA分子的切割作用在完 全肯定的位点切割DNA（识别位点下游bp）但不是对称
11、的回文顺序且 在识别序列旁边一定数目核苷酸的位置切割。反应需要ATP、Mg和SAM （S腺苷蛋氨酸）EcoP:AGACCEcoP:CAGCAG 在基因工程操作中用途不大。Ill型限制性内切酶的基本特性IV型限制性内切酶新鉴定出来的 一类限制酶。只切割碱基已被甲基化、羟甲基化、葡糖羟甲基化的 DNA 序 列。除 EcoKMcrBC 外识别序列尚未确定目前尚无应用。*核酸限制性内切酶的类型及主要特性特性I型内切酶II型内切酶 III 型内切酶内切酶的蛋白结构种不同的亚基单一成分种不同的亚基 限制作用所需要的辅助因子 ATP、Mg 和 SAMMgATP、Mg 和 SAM 寄主特异性位点识别序列 Ec
12、oB：TGA(N)TGCTEcoK：AAC(N)GTGC 回文序列旋转对称(Ils型除外)EcoP:AGACCEcoP:CAGCAG*切割 位点在距离识别位点至少bp外随机切开一条单链。位于寄主特异性位点或其附近识别位点端bp处甲基化作用的位 点寄主特异性位点寄主特异性位点寄主特异性位点识别未甲基化的 序列进行切割能能能序列特异的切割不是是不是基因工程中的用途 无用十分有用用处不大*、限制修饰系统、限制性核酸内切酶的命名 和类型、II型限制性核酸内切酶的基本特性、影响限制性内切酶活性 的因素、限制性内切酶对DNA的消化作用第一节限制性核酸内切酶 识别序列识别顺序的碱基数一般为 bp 少数识别更
13、长多数识别位点具 有旋转对称性(回文结构)少数的识别位点在切割位点之外具旋转对 称性。bpHpa I C CGGHaelll GG CCbpAvailG GWCCEcoR II CCWGGbpBamH IG GATTCSma ICCC GGGbpBg I GCCNNNN NGGCbpBstX I CCANNNNN NTGC、以某一对核苷酸为中轴左右同数目的核苷酸彼此呈碱基互补。 、这两股DNA链若按同方向阅读（如）其核苷酸顺序相同。/ GAATTC / CTTAAG，特点有二：回文序列：反向重复序列双链 DNA中含有两个结构相同方向相反的序列/GTNAC /CANTG II限制性核酸内切酶切割
14、双链DNA水解磷酸二酯键中位酯 键产生两个末端末端结构是P和OH产生种不同的切口。切 割 方 式 与 II 型核 酸内 切 酶 有 关 的几 个概 念粘 性 末端 （cohesiveends）:因酶切位点在两条DNA单链上不同（对称）酶切后形 成的具有互补碱基的单链末端结构酶切产生的两个粘性末端很容易 通过互补碱基的配对而重新连接起来。平末端（Bluntend）:因酶切位点在两条DNA单链上相同酶切后形成 的平齐的末端结构这种末端不易重新连接起来。突出的末端突出的末端i）不同的DNA双链：只要粘性末端 碱基互补就可以连接。这比连接两个平齐末端容易得多。粘性末端的意义连接便利ii）同一个DNA分
15、子内连接：通过两 个相同的粘性末端可以连接成环形分子。粘性末端可以用 DNA 聚合酶补平成平齐末端。补平成平齐末端B末端可以通过末端转移酶添加几个多聚核 苷酸的尾巴（如dA和dT）即同聚物加尾造成人工粘性末端。A末端可用DNA多核苷酸激酶进行P标记。末端标记平头末端平齐末端的特点连接困难连接效率低只有粘 性末端连接效率的这种连接常出现多联体连接。粘性末端与平齐末端连接的处理方法i）添补法：利用DNA聚 合酶I （klenowfragment）将碱基添补到目的基因的粘性末端上。ii）削除（平）法利用S和Bal等核酸酶将目的基因粘性末端的单链 突出部分削去使其成为平齐末端不同来源的酶识别相同的序列切割 方式相同或不同。识别位点和切点完全相同如Hindlll和HsuIHindlllA AGCTT TTCGA AHsuIA AGCTTTTCGA A同裂酶(Isoschizomer) 完全同裂酶：识别位点相同但切点不同。女口 XmaI 和 Smal。不完全同裂酶：XmaI C CCGGG GGGCC C SmaI CCC GGG GGG CCC识别的序列不同但能切出相同的粘性 末端。女口 BamHI、Bglll、Bell、XhoII等G GATCC CCTAG G BamHIBclI
