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1、姜黄素对人子宫内膜癌细胞增殖和凋亡的影响作者：李伟宏焦金菊王青青常志杰【摘要】目的：探讨姜黄素对人子宫内膜癌细胞（HEC1B）增殖和凋亡的影响。 方法：应用 6. 67 ? 66. 67|j mol/ L 的姜黄素分别处理 HEC IB 48h 后，采 用 MTT法检测姜黄素对HBC 1B的增殖程度的影响；流式细胞仪进行细胞周期时相分 析；荧光显微镜观察细胞核形态的变化。结果：MTT法显示培养48h后， 姜黄素组的吸光度值A490nm氐于对照组（PvO01）,且在一定浓度范围内呈剂 量 依赖性；流式细胞仪检测显示培养48h后，姜黄素组的G2/M比例高于对照 组（PvO.05），且在一定浓度范围
2、内呈剂量依赖性；荧光显微镜下给药组部分 细 胞发生凋亡形态学改变，凋亡率为 10. 22%? 34. 72%。结论：姜黄素可抑制 HRC IB的增殖，诱导细胞凋亡，其诱导凋亡的机制可能是通过将细胞阻滞在G2/M期来 实现的。【关键词】姜黄素；册 C IB; 增值；细胞周期；凋亡姜黄（curcuma）是一种传统的中药，广泛用于食品上色和调味。姜黄素 （curcumin） 是从姜黄中提取的酚性色素，是姜黄的主要有效成分，具有抗 炎、 抗氧化、抗凝、降血脂及抗动脉粥样硬化、抗肿瘤等作用，尤其作为一种具 有 良好发展前景的抗癌药物，日益引起人们的关注，成为研究的热点 1 。本 实 验采 用体外细胞培养
3、的方法来探讨姜黄素对人子宫内膜癌细胞（ Hh:CIB） 的作1 材料和方法1.1 材料111细胞株人子宫内膜癌细胞株（HKC 1B）由北京细胞中心提供。 1.1.2药物及试剂 MEM 培养液， 1: 250胰蛋白酶， Hoechst 33258染色 剂， 姜黄素C1386 （美国sigma公司）；标准胎牛血清（standard FBS，天 津灏 洋生 物制品科技责任有限公司，批号 20071230） ; Annex in V F1TC 试剂盒 （晶 美生 物工程有限公司）。1.2 方法121细胞增殖的测定（MTT法）取对数期生长的HhClB,胰酶消化制成密度为5X106/ L的细胞悬液，接种丁
4、 96孔板，每孔200m1。24h后 细胞 完全贴壁展开，更换培养液，分别设对照孔 （不加姜黄素而加等量的培养液 ）、 空白对照孔（不加细胞，其他条件与前相同 ）和不同浓度（6. 67，16.67, 33.33，66. 6 7j mol/ L）姜黄素组，每组设12个复孔。将培养板移入C02孵箱中，培养 44h后，每孔加入5g/L MTT溶液10M 1, 37 C避光孵育 电 终止培养。吸去孑L 内培养液，每孔加入100m 1DMS溶解振荡15min,待结晶物充分溶解后（溶解 呈蓝紫色 ），酶标仪检测各孔吸光值（ A490nm。） 癌细胞生长抑制率 =（1_实 验 组 A 值/对照组 A 值）。
5、1.2.2细胞周期检测取对数期生长的HBC 1B胰酶消化制成密度为5X106 /L的细胞悬液，接种于15个培养瓶内，每瓶4mL, 37 C培养箱中培养24h, 细胞完全展开贴壁。 此时换液，分别设对照组和不同浓度的（6. 67, 16.67, 33.33， 66. 6T|j mol/ L）姜黄素组，每组3个样本。继续培养48h，终止培养。4 C预冷的PBS中洗2次，用2. 5g/l胰蛋白酶消化成悬液，离心8min,去 上 清， 分别收集丁 ？ 15个EP管，每个EP管加碘化丙啶（Pl） lmL,避光孵育15min,用 流式细胞仪（FACS）分析细胞周期时相。1.2.3荧光染色凋亡细胞核形态观察
6、取对数期生长的HHX 1B,胰酶消化制成密度为5X106/ L的细胞悬液，接种于24孔培养板，每孔1.5ml。24h 后细胞完全贴壁展开，更换培养液，分别设对照孔和不同浓度的 （ 6. 67,16.67，33.33, 66. 6 7|j mol/ L）姜黄素组，每组4个复孔。继续培养48h，终止培 养。移去培养基，用冷的PBS洗3次，4%勺多聚甲醛固定30min,弃固定液， PBS 中洗3次，力卩5mg/L Hoechst33258闭光染色15min,弃掉，PBS冲中洗后荧光显微 镜 下观察细胞核形态，以核碎裂、核固缩、染色体断裂、凋亡小体形成和荧光 强 度增强等作为凋亡细胞指征。每张片随机选
7、取 4 个高倍视野，计算凋亡细胞 占 每个视野总细胞数的百分比，求出 4 个视野平均百分比，作为该样本的凋亡 百 分比，每组取 3 张盖玻片。1.2.4统计学分析实验数据以（土 s）表示，应用SPSS11.5统计软件 对 资料 进行单因素方差分析。 P0. 05 表示差异有显著性意义， P0.01 表示 差 非常显 著性意义。2 结果2.1 姜黄素对子宫内膜癌细胞增殖的影响与未加药的对照组相比，给药各组癌细胞的 A490mn 值明显降低，差异有 非常显著性意义（PV0.01），且在一定浓度范围内呈剂量依赖性，表明姜黄素对 HHC IB增殖有抑制作用，见表1。表1姜黄素对子宫内膜癌细胞增殖的影响
8、注：* P0.01,与对照组比较APv 0.01,与姜黄素I，#P 0.01,与姜黄 素II。2.2 姜黄素对子宫内膜癌细胞周期时相的影响与对照组比较，姜黄素作用48h后，子宫内膜癌细胞G0/G1比例降低，G2/M 期比例增高。在一定浓度范围内，G2/M期的比例随姜黄素浓度的增加 而增力口，并 呈剂量依赖性，差异有显著性意义（P 0.05） ，见表 2。表 2 姜黄素对 子宫内膜癌细胞周期的影响注： * P 0.05，与对照组比较 . AP 0. 05, 与 姜黄素 I ，即 0.05 ，与姜黄素 II 。2.3 姜黄素对 II 丨?:（： 115细胞凋亡的影响姜黄素各组作用 48h 后，荧光
9、显微镜观察发现，与对照组比较，姜黄素各 组细胞出现细胞核固缩、细胞核碎裂、凋亡小体等明显凋亡特征性改变（图1）o凋亡百分比从正常的6. 81%土 1.79%曾加到34. 72%土 1.88%（P001） （图2)3 讨论姜黄素是姜科植物姜黄的主要成分，具有多方面的药理作用，尤其是作为 一种 具有良好发展前景的抗癌药物，具有抗癌谱广、毒副作用小的优点，最近 被肿瘤学 家们认为是一种潜在的第三代抗肿瘤药 2 。大量体内外研究证实， 姜黄素能抑制 结肠癌 3 、肝癌 4 等的增殖，显著减少肿瘤细胞的数目， 缩小瘤体大小。本实 验应用 MTT 比色法检测姜黄素对子宫内膜癌细胞增殖的抑 制率，结果表明，
10、姜黄素 可明显抑制子宫内膜癌细胞增殖，且细胞增殖的抑制 率在一定浓度范围内随姜黄素 浓度的增加而增加，呈剂量依赖性。 MTT 试剂可 被哺乳动物活细胞线粒体中的脱氢酶还原成蓝色甲瓒颗粒，且甲瓒生成的量与 活 细 胞数量及细胞活化状态成线性关系。因此被广泛用于肿瘤药物的筛选。细胞增殖是通过细胞周期来实现的。在细胞生长周期中，存在着两个调节 细胞 周期正常进行的关键点，即Gl/S, G2/M期。近年来大量研究表明，G2/M阻滞与细 胞凋亡的发生关系密切， G2/M 期阻滞可能是 DNA 修复期使受损的 DNA 在染色体分 离前得到修复 6 ，修复成功的肿瘤细胞继续进入增殖周期。不能 修复者则进入凋
11、 亡途径。 Weir 等7 用姜黄素来处理对顺伯耐药的人卵巢癌 细胞，结果表明，姜黄 素可干扰细胞周期进程，诱导人卵巢癌细胞凋亡，并使 其阻滞于 G2/M 期。 Holy 等8 报道姜黄素可通过干扰正常的纺锤体的形成是 肿瘤细胞不能正常的有死分裂， 从而发生 G2/M 期阻滞。本实验用流式细胞仪 定 量分析细胞周期并分选不同细胞 周期时相细胞，用分析软件计算百分比，结果 提示，在一定浓度范围内姜黄素将 HBC m细胞阻滞于G2/M期，使细胞停止于DNA合成期可分裂末期，且随着姜黄 素浓度的增加 G2/M 期的细胞所占的百分比 也随之增加。本实验又应用 Hochest33258 荧光染色观察了姜
12、黄素诱导细胞凋 亡 的情况，实验结果表明，随着 姜黄素剂量的增加，凋亡率也随之增加，使细胞 向凋亡方向发展。由此推断阻止细 胞周期进程可能是姜黄素完成其抗肿瘤作用 的机制之一。综上所述，姜黄素能抑制人子宫内膜癌细胞的增殖，诱导细胞凋亡。其诱 导细胞凋亡的机制可能是通过将细胞阻滞在 G2/M 期来实现的。与细胞毒类药 物 相比，姜黄素毒副作用小，有望成为治疗子宫内膜癌的辅助性药物，促进我国 传统 抗肿瘤药的开发利用，但姜黄素具体通过何种机制阻滞细胞周期和诱导细 胞凋亡以及同目前用于子宫内膜癌常规化疗药物的疗效比较、体内实验是否有 着类似的结果、与其它抗肿瘤药物联合应用是否有协同作用等问题，有待于
13、进 一步研究。【参考文献】1 Lin JK, Pan MH, Lin Shiau SY. Recent studies on the biofunctions and biotransformations of curcumin . Biofactors. 2000， 13(1 4): 153 ? 158.2 j n JK ， Jin sh iau SY. Mechanisms of cancer chemoprevention by curcumin.Proc Natl Sci Counc ROC(B), 2001，25(2):59 ? 66.3 Johnson JJ, Mukhtar H.
14、 Curcumin for chemoprevention of colon cancer. Cancer Lett. 2007 ，255(2): 170 ? 181.4 Shi shodi a S ， Ami n H. M, Lai R, et al? Activation of NFk B isinhibited by cur cumin and related enones. Biochemical Pharmacology, 2005，70: 700.5 Bedi A ， Barber JP, Bedi GC, et al. BCR ABL mediatedinhibitionofap
15、optosis with delay of G2/M transition after DNA darhage: Amechanism of resistance to multiple anticancer agents. Blood, 1995,86(3) : 1148 ? 1158.6 Weir NM, Selvendiran K, Kutala VK ， et al. Curcumin induces G2/M arrest and apoptosis in cisplatin-resistant human ovarian cancer cells by modulating Akt and p38 MAPK. Cancer Biol Ther. 2007 ， 6(2): 178 ? 184.7 Holy JM, Deming K. Curcumin disrupts mitotic spindle structive and induccsmicronucloat-ion in MCI 7 breast canccr cc 丄丄 s. Mutat lies, 2002, 518(1) :71 ? 84.
