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1、igG的分离与提纯：硫酸铵沉淀法发布时间：2009-02-12 新闻来源：以抗原免疫动物来制备的抗血清是一个非常复杂的混合物，包括血清的全部成分。但是同抗原特异性结合 的抗体则主要是血清中的免疫球蛋白组分。通常用于制备酶标抗体或荧光抗体的免疫球蛋白必须高度纯化 并具有特异性，不应含有非抗体的血清蛋白。因此，为了浓缩和提高抗体的效价，或为制备免疫球蛋白特 异性抗体时，通常也需要分离和纯化免疫球蛋白。Y球蛋白（IgG）是血清免疫球蛋白的主要成分，约占全 部免疫球蛋白的75%，因此，抗体的分离纯化主要是分离纯化IgG。纯化IgG小量几十ml的话，用protein A或protein G就可以，疏水柱
2、等也可以纯化；大量的话，上百ml， 可以使用streamline protein A。之前根据载量估计一下需要的柱子体积。实验室中常用硫酸铉沉淀后过DEAE纤维素柱，比较简便可获较纯的抗体。下面以此方法为例介绍IgG的 分离与提纯。一、材料与试剂配制1、动物血清2、硫酸俊饱和溶液硫酸铉800g850gH2O 1 000ml加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室温过夜，然后以28%NH4OH调pH至7.0 （不调pH值也 可以）。注：硫酸铉以质量优者为佳，因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。如次品必须除去重金属，可 在溶液中通入H2S，静置过夜后滤过，加热蒸发H2S即可。3、0.01M
3、ol/L pH7.4PB 液A 液：0.10Mol/L NaH2PO4 液NaH2PO4-2H2O 15.60g加 H2O 至 1000.mlB 液：0.10Mol/L Na2HPO4 液Na2HPO4-12H2O 35.80g加 H2O 至 1 000ml取A液19ml, B液81ml加水至1000ml即可。4、1%BaCl2 溶液5、纳氏液HgI 115.00gKI 80.00g加 H2O 至 500.00ml溶化后过滤，然后再加20%NaOH500.00ml,混合即可。6、0.50 Mol/L 的 HCl 液和 0.50 Mol/L 的 NaOH 液7、洗脱液0.03Mol/L 的 Na
4、Cl 液。8、透析袋（或玻璃纸）二、操作方法1、取20ml血清，加生理盐水20ml，再逐滴加入（NH4）2SO4饱和溶液10ml，使成20%（NH4）2SO4 溶液，边加边搅拌，充分混合后，静置30min。2、3000r/min离心20min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白3、在上清液中再加（NH4）2SO4饱和溶液30ml，使成50%（NH4）2SO4溶液，充分混合，静置30min。4、3000r/min 离心 20min，弃上清。5、于沉淀中加20ml生理盐水，使之溶解，再加（NH4）2SO4饱和溶液10ml，使成33%（NH4）2SO4 溶液，充分混合后，静置30min。6、3000r/min
5、离心20min，弃上清，以除去白蛋白。重复步骤5，23次。7、用10ml生理盐水溶解沉淀，装入透析袋。8、透析除盐，在常水中透析过夜，再在生理盐水中于4C透析24h，中间换液数次。以1%BaCl2检查透析液中的SO42-或以纳氏试剂检查NH4 （取34ml透析液，加试剂12滴，出现砖 红色即认为有NH4存在)，直至无SO42-或NH4出现为止。也可采用SephadexG25或电透析除盐。9、 离心去沉淀(去除杂蛋白)，上清液即为粗提IgG (即丫球蛋白，如以36%的饱和硫酸铵沉淀血清的 产物即为优球蛋白，Euglobin，含y球蛋白)。10、过DEAE 一纤维素层析柱。以0.01Mol/L p
6、H7.4PBS (0.03Mol/L NaCl)洗脱，收集洗脱液。也可采用 SephadexG150 或 G200 柱。11、蛋白质及其定量鉴定。12、IgG的纯度鉴定可采用下列方法之一鉴定。(1) 区带电泳玻片琼脂或醋酸纤维膜电泳均可。加样电泳后，只在Y球蛋白的迁移部位出现一条带。操作时，同时可 用全血清样品，不同浓度(NH4) 2SO4盐析样品进行电泳，以资比较。(2) 琼脂双相双扩散鉴定预先准备该IgG免疫异种动物所获的抗IgG血清。将IgG与抗IgG血清进行双相双扩散，如IgG提纯的话， 则在两样品孔之间出现一条沉淀线。(3) 免疫电泳鉴定孔内加待测样品，电泳后，在槽内加抗IgG血清，琼脂扩散24h，观察结果。如果提取的IgG纯的话，则 只出现一条弧形的沉淀线，且沉淀线位于Y球蛋白区。此鉴定必须同时进行全血清及抗血清抗体的免疫 电泳，以资比较。(4) 圆盘电泳鉴定用全血清样品及提纯样品同时进行圆盘电泳。全血清样品在圆盘电泳上出现数十条区带，而纯化的IgG则 只有一条区带。13、IgG的浓缩与保存(1) IgG的浓缩(2) IgG的保存一般浓缩至1%以上的浓度，再分装成小瓶冻干保存，或加0.01%硫柳汞在普通冰箱或低温冰箱保存，注 意防止反复冻融。
