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1、igG的分离与提纯:硫酸铵沉淀法发布时间:2009-02-12 新闻来源:以抗原免疫动物来制备的抗血清是一个非常复杂的混合物,包括血清的全部成分。但是同抗原特异性结合 的抗体则主要是血清中的免疫球蛋白组分。通常用于制备酶标抗体或荧光抗体的免疫球蛋白必须高度纯化 并具有特异性,不应含有非抗体的血清蛋白。因此,为了浓缩和提高抗体的效价,或为制备免疫球蛋白特 异性抗体时,通常也需要分离和纯化免疫球蛋白。Y球蛋白(IgG)是血清免疫球蛋白的主要成分,约占全 部免疫球蛋白的75%,因此,抗体的分离纯化主要是分离纯化IgG。纯化IgG小量几十ml的话,用protein A或protein G就可以,疏水柱
2、等也可以纯化;大量的话,上百ml, 可以使用streamline protein A。之前根据载量估计一下需要的柱子体积。实验室中常用硫酸铉沉淀后过DEAE纤维素柱,比较简便可获较纯的抗体。下面以此方法为例介绍IgG的 分离与提纯。一、材料与试剂配制1、动物血清2、硫酸俊饱和溶液硫酸铉800g850gH2O 1 000ml加热至绝大部分溶质溶解为止,趁热过滤,置室温过夜,然后以28%NH4OH调pH至7.0 (不调pH值也 可以)。注:硫酸铉以质量优者为佳,因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。如次品必须除去重金属,可 在溶液中通入H2S,静置过夜后滤过,加热蒸发H2S即可。3、0.01M
3、ol/L pH7.4PB 液A 液:0.10Mol/L NaH2PO4 液NaH2PO4-2H2O 15.60g加 H2O 至 1000.mlB 液:0.10Mol/L Na2HPO4 液Na2HPO4-12H2O 35.80g加 H2O 至 1 000ml取A液19ml, B液81ml加水至1000ml即可。4、1%BaCl2 溶液5、纳氏液HgI 115.00gKI 80.00g加 H2O 至 500.00ml溶化后过滤,然后再加20%NaOH500.00ml,混合即可。6、0.50 Mol/L 的 HCl 液和 0.50 Mol/L 的 NaOH 液7、洗脱液0.03Mol/L 的 Na
4、Cl 液。8、透析袋(或玻璃纸)二、操作方法1、取20ml血清,加生理盐水20ml,再逐滴加入(NH4)2SO4饱和溶液10ml,使成20%(NH4)2SO4 溶液,边加边搅拌,充分混合后,静置30min。2、3000r/min离心20min,弃去沉淀,以除去纤维蛋白3、在上清液中再加(NH4)2SO4饱和溶液30ml,使成50%(NH4)2SO4溶液,充分混合,静置30min。4、3000r/min 离心 20min,弃上清。5、于沉淀中加20ml生理盐水,使之溶解,再加(NH4)2SO4饱和溶液10ml,使成33%(NH4)2SO4 溶液,充分混合后,静置30min。6、3000r/min
5、离心20min,弃上清,以除去白蛋白。重复步骤5,23次。7、用10ml生理盐水溶解沉淀,装入透析袋。8、透析除盐,在常水中透析过夜,再在生理盐水中于4C透析24h,中间换液数次。以1%BaCl2检查透析液中的SO42-或以纳氏试剂检查NH4 (取34ml透析液,加试剂12滴,出现砖 红色即认为有NH4存在),直至无SO42-或NH4出现为止。也可采用SephadexG25或电透析除盐。9、 离心去沉淀(去除杂蛋白),上清液即为粗提IgG (即丫球蛋白,如以36%的饱和硫酸铵沉淀血清的 产物即为优球蛋白,Euglobin,含y球蛋白)。10、过DEAE 一纤维素层析柱。以0.01Mol/L p
6、H7.4PBS (0.03Mol/L NaCl)洗脱,收集洗脱液。也可采用 SephadexG150 或 G200 柱。11、蛋白质及其定量鉴定。12、IgG的纯度鉴定可采用下列方法之一鉴定。(1) 区带电泳玻片琼脂或醋酸纤维膜电泳均可。加样电泳后,只在Y球蛋白的迁移部位出现一条带。操作时,同时可 用全血清样品,不同浓度(NH4) 2SO4盐析样品进行电泳,以资比较。(2) 琼脂双相双扩散鉴定预先准备该IgG免疫异种动物所获的抗IgG血清。将IgG与抗IgG血清进行双相双扩散,如IgG提纯的话, 则在两样品孔之间出现一条沉淀线。(3) 免疫电泳鉴定孔内加待测样品,电泳后,在槽内加抗IgG血清,琼脂扩散24h,观察结果。如果提取的IgG纯的话,则 只出现一条弧形的沉淀线,且沉淀线位于Y球蛋白区。此鉴定必须同时进行全血清及抗血清抗体的免疫 电泳,以资比较。(4) 圆盘电泳鉴定用全血清样品及提纯样品同时进行圆盘电泳。全血清样品在圆盘电泳上出现数十条区带,而纯化的IgG则 只有一条区带。13、IgG的浓缩与保存(1) IgG的浓缩(2) IgG的保存一般浓缩至1%以上的浓度,再分装成小瓶冻干保存,或加0.01%硫柳汞在普通冰箱或低温冰箱保存,注 意防止反复冻融。