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1、CIK细胞治疗慢性乙型肝炎现状（一）概述免疫细胞功能异常是造成HBV、HCV持续感染的主要原因之一，免疫细胞包括固有免疫（天然免疫）和特异性细胞免疫，其中涉及到的细胞包括自然杀伤细胞（NK细胞）抗原提呈细胞（APC）、T淋巴细胞（CTL）等。人体天然免疫的免疫细胞主要为NK细胞和NK T细胞，其非特异性天然免疫作用在机体抗感染、抗肿瘤以及自身免疫性疾病中，特别在慢性HBV、HCV感染的地位日益受到重视，认为与特异性免疫系统作用同等重要。NK细胞来源于骨髓，发育成熟依赖于完整的骨髓微环境。分布在肝、脾和外周血，骨髓中含量很少。血液中NK细胞分主群和次群，主群为CD16+CD3，占外周血淋巴细胞的
2、10%，次群为CD16CD3+、占外周血淋巴细胞的5%。NK细胞在肝脏中约占肝脏淋巴总数的35%。NK细胞名称 通常称自然杀伤细胞。稞细胞：无T、B细胞的特有标志TCR或膜Ig。大颗粒淋巴细胞：形体较大，胞质内含较大的颗粒。自然杀伤细胞：具有杀伤肿瘤细胞、病毒感染细胞等活性作用。NKT细胞：是一类同时表达恒定的T细胞受体（TCR）a、和NK细胞标志的CD4CD8、或CD4+CD8的T细胞， NKT细胞约占肝内淋巴细胞总数的20%30%，当NKT细胞活化后能迅速产生高水平的IFN-。（二） NK/NKT抗病毒、抗肿瘤作用的机制1、慢性HBV、病毒持续复制和宿主天然免疫和特异性免疫功能缺陷、低下及
3、紊乱是疾病迁延不愈的两大主要原因。清除病毒，缓解肝脏病变，除了积极合理地应用抗病毒药物长期抑制病毒复制之外，增加自身免疫细胞数量、提升免疫细胞作用，是清除病毒、治愈肝病的关键。2、NK细胞的作用一：最主要的天然免疫效应细胞群，承担着非常重要的免疫监督功能。其针对病毒感染细胞的作用特点：不需要特异性的抗原激活NK细胞；某些细胞因子、靶细胞表面结构、免疫复合物等可直接诱发NK细胞发生免疫反应；免疫反应迅速，可在数小时或1天内达到高峰；NK细胞的作用二：在抗病毒感染中主要是直接杀伤被病毒感染的细胞，在这类细胞中有损伤作用；是免疫调节细胞，作用于CD4+细胞和CD8+细胞，强化机体细胞免疫；通过其具备
4、的CD16分子辅助B细胞诱导体液免疫；分泌大量的具有抗病毒效应的炎症因子。3、NKT细胞的作用机制：具有一定NK细胞功能特征的T细胞亚群，大部份NKT细胞可能在外周免疫器官中形成。NKT细胞的激活可抑制HBV复制。NKT细胞抗病毒作用机制：与NK细胞不同，NKT细胞主要通过Fas配体系统发挥细胞毒作用；NKT细胞激活后分泌IL-4和IFN-调节Th细胞诱发免疫反应；活化其他淋巴细胞进一步抗病毒。NKT细胞不识别病毒抗原，体内NKT细胞不被清除，如能激活慢性HBV、HCV感染者肝内NKT细胞，NKT细胞天然免疫反应将打破HBV感染免疫耐受状态的特异性T细胞应答的一种补偿。4、肝脏NK/NKT细胞
5、抗病毒作用肝脏是机体免疫中起重要作用，肝脏内的免疫系统亦包括天然免疫和特异性免疫二个组成部份。包括淋巴细胞的天然免疫细胞（NK/NKT淋巴细胞占肝脏淋巴细胞的2/3）和特异性免疫细胞（T.B淋巴细胞）。肝脏的免疫状态影响慢性HBV、HCV感染的病程和转归，慢乙肝、慢丙肝患者体内发生天然免疫、特异性免疫反应的耐受多发生在肝脏组织中。慢乙肝天然免疫损伤：慢乙肝患者体内NK/NKT淋巴细胞亚群的功能呈下降趋势，但在慢乙肝患者体内。IL-2下降。活化的NK细胞及CD8+T淋巴表面的IL-2Ra链分离水平明显升高，妨碍了由IL-2诱导的免疫反应，造成肝脏内NK细胞的活化障碍。 慢乙肝特异性免疫损伤：表现
6、为T淋巴细胞功能耗竭，即从患者外周血分离出来的病毒特异性T淋巴细胞大部份失去了增殖和产生细胞因子的能力，细胞毒作用也降低，产生T淋巴功能耗竭的因素：病毒的持续存在和抗原长期作用；辅助性CD4+细胞的数量减少，Th2漂移；DC的成熟障碍，成熟的mDC表达CD80、CD86降低，对T淋巴细胞刺激能力降低。慢乙肝肝脏免疫耐受，发生肝脏免疫耐受的原因：肝脏占优势的NK、NKT细胞群具有招募外周血循环中T淋巴细胞的作用，这些招募来的活化的T淋巴易于发生凋亡；肝窦内皮细胞（LSEC）通过捕获和杀伤活化的特异性淋巴细胞，终止免疫反应；慢乙肝后肝脏微循环改变mDC的成熟障碍，不成熟的DC易诱导耐受的发生。5、
7、NK/NKT细胞与其他免疫细胞、细胞因子关系的研究 在慢性HBV，肝硬化、肝癌患者体内NK细胞数及活性均受抑制，HBV、HCV持续复制部份原因应归结于病毒抑制了NK细胞。至于外周血NK细胞数量降低，是发生在患者感染HBV以前还是之后，目前尚无定论。多种细胞因子可以诱导NK成为杀伤细胞 （CIK），外周血单个核淋巴细胞在体外经IFNr等细胞因子的诱导成CIK细胞，NKT淋巴细胞比例显著上升，可达50%以上。激活的CD8+T细胞、CD8+、CD56+、NKT细胞数量和比例都大幅度提高，细胞激活标志CD25表达百分率也增加。6、NK、NKT细胞与DC细胞间的关系树突状细胞（DC）作为专职抗原递呈细胞
8、，在抗HBV、HCV中的作用已十分明确， NK细胞与DC相互作用后能维持机体自稳状态和协助抗病毒感染。DC产生的IFN-a 介导NK细胞能释放IFN-r，其途径可能：NK细胞激活依赖IL-12和DC产生的其他细胞因子或分子；DC产生的IL-2联合其他细胞因子增强NK细胞功能。不同来源的DC细胞因子与激活NK细胞功能有不同：单核细胞源性DC分泌IL-12、P70诱导NK细胞激活，增殖，细胞毒性和CD56上调。而CD34+造血干细胞来源的DC。提供的辅助因子（IL-15和IL-18），促进NK细胞增殖和存活。7、CIK疗法临床抗HBV、HCV的进展“CIK”是英文cytokine induced
9、killer的简称，中文翻译名为“细胞因子诱导的具有NK细胞样作用的杀伤细胞”。我国1999年进行肿瘤和肝炎的研究，2002年7月批准正式应用肝癌的治疗，2004年被有关部门批准病毒性肝炎的治疗。8、CIK细胞抗肿瘤，抗病毒作用的机制CIK细胞疗法是过继性免疫疗法之一，在多种细胞因子IL2，IL1、IFNr，抗CD3单克隆抗体等诱导下将从外周血，骨髓或脐血中分离出的淋巴细胞群，经过一定时间的培养而获得的一种具有NK细胞作用的活性免疫细胞，以CD3+、CD56+细胞为主，能识别多种肿瘤细胞和病毒感染的细胞，通过与靶细胞直接接触、杀伤或分泌IFNr、TNFa，IL6等多种抗肿瘤和抗病毒的细胞因子，
10、抑制杀伤肿瘤细胞和病毒的复制。CIK细胞分泌的细胞因子能有效调节机体的免疫功能。 CIK细胞抗肿瘤、抗病毒主要通过以下3条途径：通过颗粒酶、穿孔素作用直接杀伤肿瘤和病毒感染细胞；释放细胞因子（IFN-r、TNF-a、IL-L）提高机体免疫功能，抑制肿瘤生长、病毒复制；通过Fas/FasL凋亡途径，诱导肿瘤细胞，病毒感染细胞的凋亡，见下图。 CIK细胞作用特点 CIK细胞的有效性CIK细胞培养容易，经体外诱导培养后可以几十倍甚至上百倍增长，健康人可扩增到152.667107，肝癌患者达147.5107。细胞表型发生改变，表现为CD3+T细胞，CD3+CD8+T细胞、CD25+T比例增高，从培养前
11、20%上升到60%80%。NK细胞与IL2结合后可杀死对NK细胞原不敏感的肿瘤细胞、病毒感染细胞等靶细胞。CIK细胞的效应细胞中CD3+CD56+细胞外周血中极其罕见，培养后CD3+CD56+细胞增加1000倍以上。CIK细胞治疗慢乙肝后肝硬化43例，治疗后33例HBVDNA阳性中12例转阴（36.4%），部分患者拷贝数下降。10/16例HBeAg阴转（62.5%）3例HBeAg血清转换（18.8%），部分肝功能好转，表现为ALT、IBiL下降、血清白蛋白上升。 CIK作用的专一性：回输的自体CIK细胞更具针对乙肝病毒的特异性和靶向性；具有识别病毒感染细胞能力，对HBV产生直接、主动、精确定向
12、的攻击，有效攻击HBV感染细胞而清除病毒。 CIK细胞疗效的持续性：CIK 细胞治疗是免疫细胞的治疗，通过免疫细胞数量增加、细胞表型改变、功能的增强来发挥天然免疫细胞的功能，起到直接杀伤病毒，产生细胞因子促进整体的天然免疫和特异性细胞免疫作用，从根本上解决了慢乙肝感染的免疫耐受、缺陷、低下。 CIK细胞的安全性：CIK细胞来自患者自体细胞，不会产生排斥反应，安全性好，无论理和法律问题。CIK细胞经过病毒抗原的修饰、致敏，其作用仅对HBV感染的肝细胞有攻击作用，对正常肝细胞无损害，这种方法治疗慢乙肝肝硬化，不仅HBVDNA下降，HBeAg转阴，肝功能ALT、AST、TBIL白蛋白均有明显改善。9
13、、CIK细胞治疗的适应症年龄16岁65岁。确诊为慢乙肝、慢丙肝、肝功能正常或异常，但ALT400u/L，TBiL85umol/L。慢乙肝、慢丙肝抗病毒治疗效果不佳或反弹，包括初治失败，病毒变异或耐药者。慢乙肝、慢丙肝后肝硬化代偿期患者。早、中、晚期肝癌，包括已转移的患者，手术切除、放疗、化疗等治疗前后及肝移植前患者，由于病情已不适其他治疗的患者。10、禁忌症肝硬化患者严重失代偿，高度腹水，有上消化道出血史者。肝功能明显异常者：胆红素（TBiL）85umol/L（慢性肝炎患者45umol/L）谷丙转氨酶（ALT）400u/L，凝血酶元活动度（PTA）50%，血小板（PLT）40109/L。酒精性
14、、药物性及自身免疫性肝病。合伴有恶性肿瘤、艾滋病、精神疾病及严重的心脑血管疾病，糖尿病、肾功能不全者。对注射有严重过敏史的过敏体质者，正在使用免疫抑制药物或器官移植后长期使用免疫抑制剂的患者。有明确感染如结核、细菌感染者或有发热者。孕妇或哺乳期妇女，育龄妇期患者接受治疗时必须坚持避孕。11、CIK细胞治疗的步骤一：治疗前检查肝功能，乙肝二对半（定量），HBVDNA定量，血常规，凝血功能等常规项目。用成分血分离采血机（spectrav6.1）采集患者外周血单核细胞，采集细胞数（1-4）109，体积大约4070ml，采集时间约需45分钟。将采集到的细胞在符合GMP实验室条件下进行处理、培养、诱导、激活，用无血清培养基调整细胞浓度至（1-2）106/ml（进口无血清培养基，不用外源性血清培养，避免了交叉感染的可能性）置于透气性培养袋中，在不同时间内加入一定剂量的rhIFNr、IL2、antiCD3mAD等各种细胞因子，37，5%CO2悬浮培养，所有操作过程均在严格无菌条件下进行，此过程需要912天。CIK细胞治疗的步骤二：
