蛋白质浓度测定集合

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1、、蛋白浓度的直接测定（UV法）这种方法是在280nm波长，直接测试蛋白。选择Warburg公 式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的 换算方法，将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定过程非常 简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白 质。从而显得结 果很不稳定。蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分 相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说，速 度快，操作简单；但是容易受到平行物质的干扰，如DNA 的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。（1）简易经验公式蛋白质浓度（mg/ml） = 1.45*0D280-0.74*0D260 *Dilution factor（2）精确计算通

2、过计算OD280/OD260的比值，然后查表得到校正因子F， 再通过如下公式计算最终结果：蛋白质浓度（mg/ml） = F *（1/d） *OD 280 * D其中d为测定0D值比色杯的厚度D为溶液的稀释倍数二紫外吸收法测定蛋白质含量【实验目的】1. 学习紫外吸收法测定蛋白质含量的原理。2. 掌握紫外分光光度计的操作方法。【实验原理】 大多数蛋白质分子结构中含有芳香族氨基酸(酪氨酸和色氨酸)残基，使蛋白质在280nm的紫外光区产生最大吸收, 并且这一波长范围内的吸收值与蛋白质浓度的成正比，利用 这一特性可定量测定蛋白质的含量。紫外吸收法可测定0.1-0.5mg/ml的蛋白质溶液，此操作 简便，

3、测定迅速，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因 此，此法在蛋白质的制备中广泛应用。【实验材料】1. 实验器材试管及试管架；50毫升容量瓶 2只；移液管；紫外分 光光度计。2. 实验试剂(1) 标准蛋白质溶液：精确配制2mg / ml的酪蛋白溶 液。(2) 样品溶液：配制约0.5mg/ml的酪蛋白溶液作为未知 样品溶液。实验操作】1. 绘制标准曲线取7支试管按下列各表加入各试剂管号试剂0123456标准蛋白质溶液(ml)0.00.51.01.52.02.53.0蒸馏水(ml)8.07.57.06.56.05.55.0蛋白质浓度0.000.120.250.370.500.620.7(mg/ml)0

4、5050550试剂加完后摇匀，在紫外分光光度计上，于280nm处以0号管为对照，分别测定各管溶液的光密度值。以光密度为纵 座标，标准蛋白溶液浓度为横座标，绘制出标准曲线。2. 测定未知样品取样品溶液4毫升，加蒸馏水4ml混匀，在280nm下测 定其光密度值。【实验结果】 根据样品溶液的光密度值，在绘制好的标准曲线图中查 出样品溶液的蛋白质含量。二、比色法蛋白浓度测定蛋白质通常是多种蛋白质的化合 物，比色法测定的基础是蛋白质构成成分：氨基酸(如酪氨 酸，丝氨酸）与外加的显色基团或者染料反应，产生有色物 质。有色物质的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关， 从而反应蛋白质浓度。三双缩脲法(Biur

5、et法)实验原理双缩脲(NH3C0NHC0NH3)是两 个分子脲经180C左右加热， 放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与 CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺 基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽 键，这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与 蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关， 故可用来测定蛋白质含量。测定范围为110mg蛋白质。干 扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基 酸等。9 L B P n!试剂与器材试剂：T! $ d3 V, J% A( 1 )标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白(

6、BSA ) 或标准酪蛋白，配制成10mg/mI的标准蛋白溶液，可用BSA 浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标 准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算 出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛 血清清蛋白用H2O或0.9%NaCI配制，酪蛋白用0.05N NaOH 配制。1 J 八+ : 1 L2 N ?6 C(2) 双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜(CuS045H20)和6.0克酒石酸钾钠(KNaC4H406 4H20),用500毫升水溶解, 在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升， 贮存于塑料瓶中(或内壁涂以石蜡的瓶中

7、)。此试剂可长期 保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。器材：) m, W4 G% C9 , w) O1. 可见光分光光度计) q A4 S8 X9 t, n2. 比色杯3. 大试管15支4. 旋涡混合器等。操作方法2 G0 ?3 _+八-h) F V1. 标准曲线的测定：取1 2支试管分两组，分别加入0， 0. 2 ， 0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1 毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温(2025C)下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用 未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定 的平均值，以蛋白质的含量为横座标，

8、光吸收值为纵座标绘 制标准曲线。2. 样品的测定：取23个试管，用上述同样的方法，测定 未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅 相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩 脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。四.BCA方法测定蛋白质含量【实验目的】掌握用BCA方法测定蛋白质含量的原理和操作方法 【实验原理】BCA检测法是Lowry测定法的一种改进方法。与Lowry 方法相比，BCA法的操作更简单，试剂更加稳定，几乎没有 干扰物质的影响，灵敏度更高(微量检测可达到0.5 g/ml), 应用更加灵活。蛋白

9、质分子中的肽键在碱性条件下能与Cu2+络合生成络 合物，同时将Cu2+还原成Cu+。二喹啉甲酸及其钠盐是一种溶 于水的化合物，在碱性条件下，可以和Cu+结合生成深紫色 的化合物，这种稳定的化合物在562nm处具有强吸收值，并 且化合物颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。故可用比色的 方法确定蛋白质的含量。【实验材料】1. 实验器材721分光光度计；恒温水浴槽；移液管；微量进样器； 试管架和试管。2. 实验试剂(1) BCA试剂的配制 试剂 A, 1L：分别称取 10gBCA(1%), 20gNaC0 HO232(2%),1.6g NaCHO 2HO(0.16%),4g NaOH (0.4%),9.

10、5g2 4 4 6 2NaHCO (0.95)，加水至1L，用NaOH或固体NaHC0调节pH33 值至11.25。 试剂B, 50ml :取2g CuSO5H O (4%)，加蒸馏水至4250ml。 BCA试剂：取50份试剂A与1份试剂B混合均匀。此试剂可稳定一周。（2）标准蛋白质溶液：称取40mg牛血清白蛋白，溶于蒸 馏水中并定容至100ml,制成400 g/ml的溶液。（3）样品溶液：配制约50 |d g/ml的牛血清白蛋白溶液作 为样品。【实验操作】1. 绘制标准曲线取6支干燥洁净的大试管,编号,按下表加入试剂。管号标准蛋白溶液（|!丨）蒸馏水（）BCA 试剂（ml）蛋白质含量（Ug）

11、123456050100150200250250200150100500555555020406080100上述试剂加完后，混匀，于37C保温30min,冷却至室 温后，以第1管为对照，在562nm处比色，读取各管吸光值, 以牛血清白蛋白含量为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标 准曲线。2. 样品测定准确吸取250 丨样品溶液于一干燥洁净的试管中，加入 BCA试剂5ml,摇匀，于37C保温30min,冷却至室温后， 以标准曲线1号管为对照，在595nm处比色，记录吸光值。 【实验结果】根据样品的吸光值从标准曲线上查出样品的蛋白质含 量。五.Lowry法目的掌握 Lowry 法测定蛋白质浓度的原理

12、。原理蛋白质在碱性溶液中其肽键与CU2+螯合，形成蛋白 质一铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色 化合物，在一定条件下，利用蓝色深浅与蛋白质浓度的线性 关系作标准曲线并测定样品中蛋白质的浓度。操作取试管7支、编号、按下表操作:123t空白H醮足書料0- $乩0. EG. 4o. ri.O群剽佯品1. U曜匀-宜于甜259水諮保泓“奋蚪1J r-it) N 亠a. L0. S6 咅0 60.B1-LJ 1 L 106立即混匀，在20C25C水浴保温30分钟。用660nm比色, 测定光密度值。操作注意事项：1. 按顺序添加试剂2. 试剂乙在酸性条件下稳定，碱性条件下（试剂甲） 易被破坏

13、，因此加试剂乙后要立即混匀，加一管混匀一管， 使试剂乙（磷目酸）在破坏前即被还原。计算（一）绘制标准曲线。以浓度为横坐标，光密度值为 纵坐标绘制标准曲线。（二）以测定管光密度值，查找标准曲线，求出待测 血清中蛋白质浓度（g/L）。（三）再从标准管中选择一管与测定管光密度相接 近者，求出待测血清中蛋白质浓度（g/L）。器材（一）721型分光光度计(-)恒温水浴箱(三)中试管7支(四) 刻度吸管：1. 0ml 二支；0.5ml 支；5.0ml一支。试剂(一)试剂甲(1) 4%碳酸钠(Na CO)溶液23(2) 0.2N 氢氧化钠溶液(3) 1 %硫酸铜溶液(CuSO 5H O)42(4) 2%酒石

14、酸钾钠溶液(或酒石酸钾或钠) 在使用前(1)与(2)、(3)与(4)等体积混合，再将两混合液按 50：1 比例混合，即为试剂甲。该试剂只能用一天， 过期失效。(一)试剂乙：(1 )市售酚试剂在使用前用NaOH滴定，以酚肽为指标剂，根据试剂酸度将其稀释，使最后酸度为 1N。(2)或取 Na WoO 2H O l00g 和 Na MOO25g。溶24223于蒸馏水700m丨中，再加85% HPO 50ml和HCI(浓)100ml,34将上物混合后，置 1000ml 圆底烧瓶中温和地回流十小时，再加硫酸锂(Li2SO4H2O)150g，水50ml及溴水数滴。继续沸 腾15 分钟后以除去剩余的溴，冷却后稀释至1 000m l 然后过 滤，溶液应呈黄色或金黄色(如带绿色者不能用)，置于棕色 瓶中保存，使用时用标准 NaOH 滴定，以酚酞为指示剂，而 后稀释约一倍，使最后酸度为 1N。（三）标准蛋白质溶液 用结晶牛血清白蛋白，根据其纯度用蒸馏水配制成 0.25mgml 的蛋白质溶液。（纯度可经凯氏定氮法测定蛋白 质含量而确定）。（四）待测样品：准确取血清0.1ml,置于50ml容量瓶中，再加 0.9NaCl 溶液至刻度，充分混匀，也可以用尿 液为样品。