《细菌感受态的制备和质粒的转化》由会员分享，可在线阅读，更多相关《细菌感受态的制备和质粒的转化（4页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、实验细菌感受态的制备和质粒的转化实验目的通过实验学会感受态细胞的制备方法和DNA转化的最基本操作，以及如何 提高转化效率的思路。本实验综合因素较多，难度较大，是分子生物学中的一个 很关键的实验手段。实验原理转化是指某一细胞系由于接受了外源DNA，而导致其原来的遗传性状发生 改变，这种遗传性状包括遗传型和表型的改变。感受态是受体菌能接受外源DNA能力的一种生理状态。用CaCl2处理细菌， 改变细胞膜的结构，使质粒DNA能够穿过细菌细胞膜进入细胞。然后在选择性 培养基中培养转化处理过的细菌，转化成功的细菌可以在选择性培养基上生长形 成菌落。本实验采用质粒pUC118转化大肠杆菌DH-5，通过氨苄青
2、霉素抗性筛选转 化子。pucn&pucng日 5)Q3B 知里B7?&,-GCCAA(3CTTaCAT0CCTGCAa3TCGJSJCTCTAGA&G!ATCCC；GGGrALCGAGC7CGAArrC-JHfndlU 咐 1I3 |M ik H,n * 1I71 Ecdfl II财 IIXjsmiP4JCHIB;M1 fl755 GAATTqtAqCTCM.TAGCCGGGG.*TCCTCTi*&*-GTCGACCrGCA&CATGCAAQCriGG-T11I. l I.JTmolMda nhnrtg (fit图 1-1 质粒 pUC118/pUC119 图谱实验材料和试剂（一）实验材料大肠
3、杆菌DH-5a质粒 pUC118 ( ampicillin, AmpR )(二) 培养基和试剂1. LB液体培养基（）0.51.00.5胰蛋白月东（Tryptone）酵母浸出粉（Yeast extract）NaCl pH 7. 27.4 （用 2mol/L NaOH 调节）（分装:20ml/250ml三角瓶，每组2瓶。3ml/试管，每组2 管0 0.07Mpa 高压灭菌30分钟）。2. LB固体培养基LB液体培养基加入1. 6%的琼脂粉即可。（分装：50ml/250ml三角瓶，加入0.8克琼脂粉，每组1瓶。0.07Mpa 高压灭菌30分钟）。3. 抗生素：氨苄青霉素（ampicillin, A
4、mp），配制成100mg/ml备用。4. 0. 1mol/L CaCl2 溶液（配制方法称取1.1克无水CaCl2溶于90ml蒸馏水中，定容至100ml, 装于250ml三角瓶中，0.07Mpa高压灭菌30分钟，4C保存。）（三）器材接种针10ml移液管50ml塑料离心管5ml移液管90mm培养皿1ml移液管1.5ml Eppendorf 管200pl 吸头三角爬15X150试管冰块试管铝帽牛皮纸纱布盖线绳硫酸纸（四）仪器摇床机离心机净化工作台恒温水浴锅培养箱实验步骤以下均需无菌操作（一）感受态细胞的制备1. 大肠杆菌DH-5a冷冻保存的菌种，挑取一环，划线接种在LB固体培养 基平板上（活化菌
5、种），37C培养过夜（约16小时）。2. 从长好的平板上挑取一个单菌落，转接在含有3ml LB液体培养基的试管 中，37C振荡培养过夜（约16小时）。3. 取0.3ml菌液接种于20ml LB液体培养基的250ml三角瓶中，37C振荡 培养23小时，待OD600值达到0. 30. 4时，取下三角瓶，立即置冰浴10 15分钟。4. 将细菌转移到一个灭菌的50ml离心管中，4C 3000r/min离心10分钟， 弃去上清液（尽可能将所有的上清液去净），收集菌体。5. 加入20ml用冰预冷的0. 1mol/L CaCl2溶液，重新悬浮菌体，使菌体分散 均匀，置冰浴中30分钟。6. 4C 3000r/
6、min离心10分钟，弃去上清液（尽可能将所有的上清液去净）。7. 再加入2ml用冰预冷的0. 1mol/L CaCl2溶液，小心重新悬浮菌体（操作 要轻）。在4C冰箱中放置1224小时，即可应用于DNA转化。（二）细菌的转化1. 取大肠杆菌DH-5a新鲜感受态细胞100l于1.5ml Eppendorf管中，加入 50100ng质粒pUC118 DNA，轻轻旋转以混合内容物，在冰浴中放置30分钟。2. 42C热休克120秒，不要摇动Eppendorf管。3. 加入LB液体培养基900皿，37C保温60分钟。4. 取100Rl转化液涂布在含氨苄青霉素（Amp） 100曜/ml的LB固体平板 上，37C倒置培养1624小时。5.观察平板，长出的菌落可能就是转化子，可进一步提取质粒鉴定。【提示】实验操作中注意的问题1. DNA与感受态细胞混合后，一定要在冰浴条件下操作，如果温度时高时 低，转化效率极差。2. Eppendorf管盖紧，以免反应液溢出或外面水进入而污染。3. 42C热处理时很关键，转移速度要快，但温度要准确。4. 涂布转化液时，要避免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变 化，过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。【思考题】1. 制备感受态细胞的关键是什么？2. 如果DNA转化后，没有得到转化子或者转化子很少，分析原因。3. 如何提高转化效率？
