碳粉廓清法

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1、第五篇 有关免疫调节剂筛选及评估机体免疫状态的实验第一章 检测非特异免疫功能的实验第一节 小白鼠碳粉廓清试验基本原理静脉注射一定大小的颗粒物质，迅速被肝、脾等器官内网状内皮细胞吞噬而使其在血浆浓度降低，因此可从其廓清率了解整个单核巨噬细胞系统的吞噬功能。材料和仪器印度墨汁0.1%Na2CO 3 溶液毛细滴管72 分光光度计操作步骤1. 体重18 一 22g小白鼠，雌雄各半，随机分为实验组与对照组。2. 每鼠尾静脉注射印度墨汁0.05ml/kg体重，于1 （切和5 （t5）分钟后分别从眼眶 静脉取血20u1,加到2ml、0.1%Na2CO3溶液中摇匀；3. 用72型分光光度计在680mm下比色，

2、测光密度（以下分别用OD和OD5来表示1 分钟和 5 分钟所取血样的光密度）；4. 按下式计算廓清指数K值：廓清指数 K=LogOD1logOD5T5-tLogOD1/OD54K值经体重及肝脾重换算后.得吞噬指数a值:吞噬指数a =体重/肝脾重X 3k以XSD来表示给药组与对照组的k值和a值，进行组间t检验，比较差异的显 著性。注意事项1. 印度墨汁应用生理盐水稀释 l 一 5 倍左右。最好经超声处理后离心，弃出沉淀物 以免凝集的碳粒阻塞肺毛细血管，引起动物致死。2. 尾静脉注射要熟练，取血时间也可延长至10 分钟，但必须准确无误。参考文献刘辉 2000 研究生免疫学教程 大连 大连出版社 2

3、58-259（张璐 刘辉）第二节 小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬试验基本原理通过定量地观察巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬情况，反映小鼠巨噬细胞的吞噬能力。材料和仪器 5%鸡红细胞生理盐水悬液 37 C孵箱 固定液：1:1 丙酮甲醇溶液 染色液：4%(V/V) Giemsa 磷酸缓冲液 垫有湿纱布的搪瓷盒操作步骤1 取体重 18 一 22g 的健康小白鼠随机分成给药组试验组、阴性对照组和阳性对 照组。2每鼠腹腔注射5%鸡红细胞生理盐水悬液0.5ml。3 8-12小时后，颈推脱臼处死小鼠；正中剪开腹壁皮肤，经腹膜注入生理盐水2ml, 轻轻按揉鼠腹部1分种，然后吸出腹腔洗液lml,分滴于两片载玻片上，放人垫有湿纱

4、布 的搪瓷盒内，移置37C孵箱温育30分钟。4 以生理盐水漂洗，以除去未粘片的细胞，晾干。5 1:1 丙酮甲醇溶液固定 5 分钟。6 4%(V/ V) Glemsa 一磷酸缓冲液染色 3 分钟，用流水冲洗，晾干。7 结果判定：油镜下计数巨噬细胞，每片200个按下式计算吞噬百分率和吞噬指数。吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数吞噬百分率=X 100%200个巨噬细胞(吞及未吞噬的)被吞噬的鸡红细胞吞噬扌旨数=三22 0 0个巨噬细胞在计数时，应同时观察鸡红细胞被消化的程度，借以判定巨噬细胞吞噬和消化功能通常分为 4 级：I级：未消化。被吞噬的鸡红细胞完整，胞质浅红或浅黄绿色，胞核浅紫红色。II级；轻度消化。

5、胞质浅黄绿色，胞核固缩呈紫蓝色。III级：重度消化。胞质淡染，胞核呈浅灰黄色。IV 级：完全消化。巨噬细胞内仅见形态类似鸡红细胞大小的空泡，边缘整齐胞核隐 约可见。注意事项1. 实验过程中应注意无菌操作。2. 若筛选免疫抑制药，预先可用巨噬细胞诱导剂，在实验前34 天，腹腔注射 0.5淀粉 生理盐水溶液，每鼠0.5m 1。免疫增强剂多可激活小鼠腹腔巨噬细胞，并增强其吞噬功 能一般不再使用巨噬细胞诱导剂。3. 若滴片染色过深，可用1%HCI脱色；过浅则可复染。4. 每鼠两片的计数应基本一致，若差距过大，应予淘汰。由小鼠腹腔吸出的液体为出血性 渗出液时，不宜使用。5. 必要时用低渗法溶解胞外红细胞

6、，这样容易鉴别细胞内外的鸡红细胞。6. 本法简便但难于测定吞噬速率及其动力学改变，而且费时。参考文献1. 巴德年 1998 当代免疫学技术与应用北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出 版社， 261263张璐 刘辉）第三节 溶菌酶测定法（光学法）基本原理 体液或分泌物中溶菌酶活性可以通过检查其对指定敏感菌株的裂解作用来进行测定，将 检品与菌液混合，用分光光度计观察指定时间内透光度改变的百分数反映溶菌酶的活性。材料与仪器 菌种；溶壁微球菌（Micrococus Lysodeilicus）是从空气中分离出的一种革兰氏阳性球菌, 菌落呈黄色，普通培养基上生长良好，1个月传代1次或冻干成菌种保存。

7、PH6.4,1/15M磷酸盐缓冲盐水（PBS）： 1/15M磷酸二氢钾溶液：磷酸二氢钾9.04g,，加蒸馏水至1000ml。 1/15M磷酸氢二钠溶液：磷酸氢二钠2H2O11.87g,加蒸馏水至1000ml。 PH6.4, 1/15M PBS：1/15M磷酸二氢钾溶液73ml, 1/15M磷酸氢二钠溶液27ml，氯化钠 0.5g 混匀，溶解即成。 溶菌酶标准品：结晶纯品。 5N 氢氧化钾：氢氧化钾 56g 加蒸馏水至 200ml。 分光光度计操作步骤1. 菌液制备：将溶壁微球菌接种于普通琼脂斜面上，37C培养24 一 36小时.用PH6.4、 1/15M PBS洗下，配成混悬菌液。用分光光度计

8、波长640nm测定，并调整其浓度达到 透光率3 0 40%。2. 溶菌酶标准液：称取溶菌酶标准纯品，用PH6.4、l/ 15M PBS配成1000ug/ml原液， 放冰箱保存。临用时再稀释成100、50、25及10ug / ml标准液。3. 检品应根据估计溶菌酶含量作适当稀释.取适当稀释（或不稀释）检品0.2ml放小试管 内。置37 C水浴箱预热5分钟，再向管内加人预热的菌液1.8ml混匀，立即记下开始 时间，至2分钟时加入1滴5N氢氧化钾停止反应，立即将菌液倒入比色杯内.用640nm 滤光板，0.5cm比色杯测其透光率-%。4. 另取同样浓度的检品0.2ml先加入1滴5N氢氧化钾摇匀，在37

9、C预热5分钟，再 加入1.8ml经37 C预热的菌液，在同样温度下2分钟后同法测定其透光率T。T1/一 T0%为透光率差值，即溶菌酶所致透光率的变化，从标准曲线上可查得检品中溶菌酶 含量。5. 计算：以0.2ml各种浓度的溶菌酶标准液代替检品，操作步骤与待检品相同。以不同浓 度标准液测得的透光率差值为纵坐标（ 对数坐标），溶菌酶浓度为横坐标，在半对数纸 上绘制标准曲线。按检品的T%（2分钟的读数减去零时的读数）查出其对数，由标准 曲线上查出稀释的检品中溶菌酶的含量，乘以稀释倍数，即为检品中溶菌酶的含量。 注意事项溶菌酶是一种小分子蛋白质，存在于机体的泪液、唾液、痰、鼻涕、白细胞和血清等。 测定

10、它在体液或分泌物中的含量及其变动情况，可作为侧面了解机体防御功能一个指标。在 选择标本及评价其意义时应予以注意。参考文献刘辉 2000 研究生免疫学教程 大连 大连出版社 260261（张璐 刘辉）第四节 溶菌酶测定法（平板法）基本原理 体液或分泌物中溶菌酶活性可以通过检查其对指定敏感菌株的裂解作用来进行测定，在 混有菌液的琼脂疑胶上打孔，将检品放在孔内，一定时间后测定溶菌环的直径。可反映溶菌 酶的活性。材料与仪器 菌种：溶壁微球菌（Micrococus Lysodeilicus）是从空气中分离出的一种革兰氏阳性球菌, 菌落呈黄色，普通培养基上生长良好，1个月传代1次或冻干成菌种保存。 PH6

11、.4,1/15M磷酸盐缓冲盐水（PBS） 1/15M磷酸二氢钾溶液：磷酸二氢钾9.04g,，加蒸馏水至1000ml。 1/15M磷酸氢二钠溶液：磷酸氢二钠2H2O11.87g,加蒸馏水至1000ml。 PH6.4, 1/15M PBS：1/15M磷酸二氢钾溶液73ml, 1/15M磷酸氢二钠溶液27ml，氯化钠 0.5g 混匀，溶解即成。 溶菌酶标准品：结晶纯品。 普通琼脂培养基操作步骤1. 菌液制备：将溶壁微球菌接种于普通琼脂斜面上，37C培养24 一 36小时.用PH6.4、 1/15M PBS洗下，配成混悬菌液。用72型分光光度计波长640nm测定，并调整其浓度 达到透光率3 0 40%

12、。2. 溶菌酶标准液：称取溶菌酶标准纯品，用PH6.4、l/ 15M PBS配成1000ug/ml原液， 放冰箱保存。临用时再稀释成100、50、25及10ug / ml标准液。3. 加热融化1.2%琼脂粉，待冷却至60-70C时将溶壁微球菌混入摇匀，使其浓度为1mg/ml， 立即倾入已夹好的两玻片中（厚度为4mm）。4. 待琼脂凝固后，以15mm间隔，用打孔器穿钻2.5mm直径小孔，每孔中加入20ul检样 品，并在同一板上加上不同浓度的标准溶菌酶样品，置24-26 C ， 12-18 小时，用测微 尺测溶菌环的直径。5. 用半对数纸（以溶菌酶浓度为纵坐标，即对数坐标，溶菌环直径为横坐标）绘制

13、标准曲 线。从线上查出每毫升样品所含溶菌酶的ug数。注意事项在缺乏培养细菌的条件下也可使用干菌粉，将溶壁微球菌24小时培养物用60 倍体积蒸馏水 洗下，离心沉淀弃上清液，沉积的菌体加约5 倍体积的丙酮，用玻棒搅匀，放冰箱内30分 钟、取出离心沉淀弃上清液。按此法用丙酮浸洗3 次，再用乙醚洗2 次，将菌体放于燥器内 过夜，即得干菌粉。用乳体研碎备用，使用时称干菌粉500mg,放人上述磷酸缓冲液约50ml, 如上调整菌液浓度约30一40%.参考文献刘辉 2000 研究生免疫学教程 大连 大连出版社 260261（张璐 刘辉）第二章 检测特异性免疫功能的实验第一节 血清溶血素测定基本原理经绵羊红细胞

14、（SRBC）免疫动物的淋巴细胞可产生抗SRBC抗体（溶血素）。并释放 至外周血。这种抗体在试管内与SRBC温育.在补体参与下可产生溶血反应.免疫动物血清 中溶血素的含量可以通过溶血过程中释放的血红蛋白来测出。材料与仪器 SRBC保存液（Alsever液）；葡萄糖2.05g,氯化钠0.42g,柠檬酸钠0.8g，蒸溜 水100ml,无菌过滤（G碉斗）或8磅10分钟灭菌后备用。 都氏试剂（测血红蛋白用）；碳酸氢钠1.0g，高铁氰化钾0.2g,氰化钾0.05g，蒸 馏水 1000ml。 补体：新鲜豚鼠（至少3只）混合血清经SRBC （10:1）于4C吸收30分钟后置-20 C以下备用。 SRBC：在无

15、菌条件下，自健康成年绵羊外颈静脉取血，置血液于有玻璃珠的三角 烧瓶中轻摇10分钟以除去纤维蛋白，加人2倍量的保存液，置4C冰箱备用。临 用时用生理盐水洗涤3次，经2000rpm10分钟得压积红细胞，再按所需浓度稀释。操作步骤1. 免疫；小鼠腹腔注射20%SRBC 0.2ml/天，免疫后第4天去眼球或腹动脉取血，分离 血清，将血清稀释（一般500倍以上）后供测定。2. 溶血反应：反应管内依次加人经稀释的血清lml，5%SRBC0.5ml, 10%补体lml.置3. 37C恒温水浴中保温30分钟，然后移至冰浴中终止反应，1500rpm离心5分钟，取血 清液lml加都氏试剂3ml，摇匀放置10分钟，于540nm波长比色读取吸光度。4. SRBC半数溶血值：取5%SRBC 0.25ml加都氏液至4ml,比色读取吸光度值，即为实 验中所用SRBC半数溶血时的吸光度值。5. 计算：样品管中数溶血值CH50按下式计算：每只鼠的血清 样品的吸光度值 X稀释倍数 CH50= SRBC 半数溶血时的吸光度值注意事项免疫用SRBC浓度可根据不同