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1、实验六高效液相色谱(HPLC)柱效测定一. 实验目的1、学习高效液相色谱仪的基本操作方法。2、了解高效液相色谱仪原理和条件设定方法。3、了解高效液相色谱法在日常分析中的应用。二. 实验原理高效液相色谱法是以液体作为流动相，借助于高压输液泵获得相对较高流 速的液流以提高分离速度、并采用颗粒极细的高效固定相制成的色谱柱进行分离 和分析的一种色谱方法。在高效液相色谱中，若采用非极性固定相，如十八烷基键合相，极性流动 相，即构成反相色谱分离系统。反之，则称为正相色谱分离系统。反相色谱系统 所使用的流动相成本较低，应用也更为广泛。定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的 分离度
2、。分离度(R)的计算公式为：R= 2t -t /1.7*(Y +Y )(R2)(R1)1/21/2式中t为相邻两峰中后一峰的保留时间；t为相邻两峰中前一峰的保留 (R2)(R1)时间；Y与Y为此相邻两峰的半峰宽。除另外有规定外，分离度应大于1.5。 1/2 1/本实验对象为邻苯二甲酸酯，又称酞酸酯，缩写 PAE，常被用作塑料增 塑剂。它被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和 壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品，如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗 发液等数百种产品中。但研究表明，邻苯二甲酸酯在人体和动物体内发挥着类似雌性激素的作用，是一类内分泌干扰物。待测物性质见表1。表1色谱柱
3、测试条件出峰次序样品组成1邻苯二甲酸二甲酯(DMP)2邻苯二甲酸二乙酯(DEP)3邻苯二甲酸二丁酯(DBP)如果要检测不同条件对谱图分离的影响，可按表1配制几种物质的混合溶 液，在不同条件下进行HPLC分离检测。三仪器与试剂1、仪器Agilent 1100高效液相色谱仪，50ul微量注射器。2、试剂甲醇(色谱专用)，高纯水四.实验步骤1、色谱条件色谱柱：苯基柱，柱温：室温流动相：初始为咼纯水：30%，甲醇：70%检测器：DAD检测器(二极管阵列检测器)；检测波长：220nm；进样体积：20pl定量环，实际注射每次可控制在40pl。2、待测溶液的配制首先用甲醇做溶剂配制储备液：邻苯二甲酸二甲酯(
4、0.3880g/L),邻苯二甲 酸二乙酯(0.2770g/L),邻苯二甲酸二丁酯(0.3776g/L)。然后各取1mL储备液 用水和甲醇(20： 80)稀释至10mL，作为待测溶液。3、色谱测定 按操作规程开启电脑，开启脱气机、泵、检测器等的电源，启动Agilent 1100 在线工作软件，设定操作条件。流量为1.000ml/min。 待仪器稳定后，开始进样。将进样阀柄置于“LOAD”位置，用微量注射器吸 取混合物溶液50ul,注入仪器进样口，顺时针方向扳动进样阀至“INJECT”位置, 此时显示屏显示进样标志。(3) 记下各组分色谱峰的保留时间及峰面积及分离比。(4) 实验完毕，清洗系统及色
5、谱柱。依次用甲醇-水(60：40)、甲醇-水(70：30) 直到纯甲醇作流动相清洗，每次清洗至基线走稳，至少清洗15min。五实验结果(1) 流动相的比例为：高纯水：20%甲醇：80%，流速为1ml/min，记录色谱图, 并计算分离度；3000等梯度洗脱peak number retention time(min) peak width at half height1 3.1540.10452 3.7230.10393 6.4770.1716峰 1 与峰 2 之间的分离度：R(resolution)= 2t -t / 1.7*(Y +Y )1(R2)(R1)1/21/2=2* (3.723-3
6、.154)/1.7*(0.1039+0.1045)=3.21峰 2 与峰 3 之间的分离度：R2(resolution)= 2t -t /1.7*(Y +Y )2(R2)(R1)1/21/2=2*(6.477-3.723)/1.7*(0.1039+0.1716)=11.76从峰与峰之间的分离度：3.21与11.76可以看出，三种物质分离的已相当 的好，分离度很高。虽然等度洗脱分离度已经很高，但是出峰时间却较长，所以为了缩短时间， 我们必须调节洗脱液按梯度浓度来进行洗脱。(2) 梯度洗脱程序为：timemethanol%0801.5903100580 其色谱图如下:A01 B. Siq=220,
7、 16 R&f=3fiO 100 (12090008.D)mAU200015001000500ocsln OSs.5-3-tu, - 丁3 S 二N2 8_1- 篇上+-1 00百0peak number retention time peak width at half height1 2.9310.08952 3.3340.08373 4.3600.0949峰 1 与峰 2 之间的分离度：R(resolution)= 2t -t / 1.7*(Y +Y )1(R2)(R1)1/21/2=2* (3.334-2.931)/1.7*(0.0837+0.0895)=2.74峰 2 与峰 3 之间
8、的分离度：R2(resolution)= 2t -t /1.7*(Y +Y )2(R2)(R1)1/21/2=2* (4.360-3.334)/1.7*(0.0949+0.0837)=6.76(3) 梯度洗脱程序为：time01.53methanol%909010090F面是我们所得到的色谱图： II4VM A 1 DM* 乳厶宅 44 jq*亠理寻 rDADI B. SigSSO. 1 & Ref=3s 100iXSOOM.DfmAU2000peak numberretention time2.5032.6573.224peak width at half height0.08290.075
9、30.0915峰 1 与峰 2 之间的分离度：R(resolution)= 2t -t / 1.7*(Y +Y )1(R2)(R1)1/21/2=2* (2.657-2.503)/1.7*(0.0753+0.0829)=1.02峰 2 与峰 3 之间的分离度：R2(resolution)= 2t -t /1.7*(Y +Y )2(R2)(R1)1/21/2=2* (3.224-2.657)/1.7*(0.0753+0.0915)=4.0按此洗脱程序，我们可以看见，出峰时间由上程序的4.4min降到了本次的3.2min,可以说又缩短了不少时间，然而我们却可以看到峰2与峰1重叠了，没 有分开，他们
10、之间的分离度只有1.02.可见时间固然宝贵，然而分离效果才是根 本。(4)定性过程DMP采用第二个样品的梯度洗脱程序：实验得到如下的色谱图下：IStHN从色谱图我们可以知道，在实验二的梯度洗脱程序中，DMP的出峰时间为 2.950min。对比实验二的色谱图，我们可以看见在2.931也有一个峰，可以判定, 在三种物质的混合液中，DMP最先出峰。这是由于DMP的极性在三者中最大的 原因。六.思考题(1) 比较图2和图3可知，在缓冲液作流动相的情况下，实验得出的峰形 较好。但为什么实验室尽量不用缓冲溶液作流动相？DAD1 B. Sig=220.16 Re360.100 (31SX31SM0004.D
11、)mAUSOO-600-400-200-1：234!5878Ei*图3乙腈-水（5： 95）作流动相得出的色谱图1）缓冲溶液会缩短色谱柱的使用寿命；2）缓冲溶液还要现配现配现用，否则时间久了，缓冲溶液容易滋生微生物， 堵塞色谱柱；3）在梯度洗脱中使用缓冲溶液，如果洗脱液的有机物比例比较高，缓冲溶 液容易析出，导致色谱柱的堵塞。4）由于本次实验要分离的体系很简单，且不做定量。所以虽然出的峰比较 差，但不影响教学效果，所以没必要。而且使用缓冲溶液后，洗柱更麻烦，必须 先用低有机物浓度溶液进行洗柱，然后才可以用纯甲醇洗柱。（2）流动相在使用前为什么要用砂芯漏斗过滤？这是由于色谱柱的内径小，填充物的粒
12、径只有0.5um，色谱柱内填充物 堆积很密集，导致空隙小，要是进入了固体小颗粒，很有可能会堵塞色谱柱，对 色谱柱造成损害，所以流动相在使用之前必须用砂芯漏斗过滤。（3）请分析实验结束后，怎样清洗柱子。分为两种情况，第一种情况为流 动相用到缓冲溶液，第二种情况为流动相不用缓冲溶液？如果流动相用到缓冲溶液如磷酸盐缓冲溶液，在实验完成之后，要先用 低有机物浓度的溶液清洗管路，然后再用纯有机物清洗管路，直到柱压降到60 左右Barr为止；如果实验中没有用到缓冲溶液，则可以直接有纯有机物清洗管 路，直到柱压降到60Barr左右。（4）根据实验结果分析，流动相中水的比例多少对分离度、出峰时间的影 响。根据
13、实验结果分析，当洗脱程序如下是分离效果最好。time01.5methanol%80903100580 又通过和等梯度洗脱与另一个梯度洗脱程序效果对比，我们可以得出： 流动相中水的比例越高，分离度越好，出峰时间越长； 流动相中的水的比例越低，分离度越低，出峰时间越短； 可见在分离度与出峰时间两方面。我们必须做一个折中，在保证完全分离的前提 下，尽可能的缩短出峰时间。七，实验小结（1）本次实验主要是探究梯度洗脱对分离效果的影响，梯度洗脱对于液相色 谱的重要性，和程序升温对于色相色谱的重要性一样，是影响分离效果的主要影 响因素，因此在进行探究实验时，必须不断地优化梯度洗脱，找出最适宜的梯度 洗脱程序
14、，这样才能使实验在最短时间内做出最理想的结果。（2）高效液相色谱特别适合分离分析大分子、高沸点、强极性、热不稳定性 化合物，以及具有生物活性和多种天然产物，弥补了气相色谱的不足。近年来， 由于生命科学的兴起与备受关注，高效液相色谱的作用也就更加明显。（3）液相色谱与气相色谱的分离原理是一样的，然而其仪器设备却又有比较 大的区别：1,气相色谱柱的毛细管柱细而长，可达几十米；液相色谱的色谱柱主要是 填充柱，它们的长度多为：1020cm，虽然短，但是其柱效却不低，可以说是 短小精悍。2，液相色谱要用到高压泵，其柱头压可以达到80左右个大气压，而气相 色谱中的载气压力只有半个大气压左右。这主要和液相色谱柱的填充物质的粒径 和密集程度有关，色谱柱的流通体积很小，不得不用高压泵，这也是它做的比较 短的原因，要是他也弄个几十米，恐怕一两天物质也未必出峰。3，在检测器方面，气相色谱主要使用：FID,ECD,MSD,FPD等，而液相色 谱却使用：UV-VIS,PDAD,DRD等，本次实验所用的时UV-VIS，其内部的检测 器是 DAD （二极管阵列检测器）。八，参考资料1, 现代仪器分析技术及应用魏福祥等著中国石化出版社2,
