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1、肿瘤坏死因子摘要恶性肿瘤疾病目前仍是全世界需要共同面对的一个医学难题，其发病隐匿，早期容易被无视，而临床患者多数已到中晚期，此时的疾病已很难治疗。肿瘤坏死因子是一种能使肿瘤出血，并能抑制、杀伤体外培养的肿瘤细胞的蛋白类物质，1984年TNF基因的克隆开辟了临床试验的时代，是第一个用于肿瘤生物疗法的细胞因子，但因其缺少靶向性且有严重的副作用，对该基因的研究和应用形成了很大的障碍，目前很多研究人员正致力于该基因改造与应用。关键词TNF、肿瘤1TNF的生物学特征TNF按其结构可以分为两种：TNF和TNF。TNF是一种单核因子，主要由活化的单核细胞和巨噬细胞产生，TNF是一种淋巴因子，由活化的T细胞和
2、NK细胞产生，目前研究多为TNF。人的TNF位于第6号染色体短臂上，与MHC紧密连锁1，人的TNF基因大小为2.76kb，由4个外显子和3个内含子组成。TNF的蛋白质结构有多种形成，有二聚体、三聚体、五聚体，其中有生物活性的是三聚体。TNF位于TNF的5端，同样由4个外显子和3个内含子构成，其中第4个外显子与TNF高度同源，编码80%-90%的成熟蛋白质。2 TNF的来源与表达TNF在人体内的来源途径有很多，如单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞、成纤维细胞等都可以在一定的条件下产生和释放TNF。目前认为TNF主要的生物合成场所有心、肝、肺、肾2。各种外来刺激如内毒素脂多糖(LPS)、肠毒素、霉菌抗原
3、、某些寄生虫的溶解物、病毒颗粒等，均可以引起TNF的表达与释放。在正常情况下，TNF只由心肌间质的巨噬细胞产生，在某些病理状态下，如感染或内毒素的刺激下，心脏可以产生TNF，Giroir3等研究证实这一点，在这些应激状态下，成熟的心肌细胞同样可以产生TNFmRNA及其蛋白质，且产生的量同巨噬细胞产生的差不多。Kleine等4证实，在生理状态下，脑内在结构和功能方面与巨噬细胞相似的细胞如神经元、小胶质细胞、血管内皮细胞均可合成分泌TNF、IL-6等细胞因子。在炎症情况下，这些细胞因子的水平明显升高，且对中性粒细胞有明显趋化作用5。有研究说明，有大约20%的恶性肿瘤的发生与慢性炎症有关6。3 TN
4、F受体通过对TNF分子一级结构的研究说明，C-末端在TNF的生物学活性中起决定性作用。由于C-末端参与TNF高级结构的构成，只要切掉1个氨基酸就可使TNF丧失生物学活性。而N-末端的变化范围较大，适当改变其长度并不影响其生物学活性，N-末端还与TNF对受体的结合能力密切相关，可能为与受体结合的部位。TNF生物学效应的发挥，有赖于其与靶细胞上的TNFR相结合，并通过受体后效应将信号传至胞核。TNFR存在于多种细胞外表，肿瘤细胞外表同样也存在TNFR7，不同细胞外表上受体的数目以及亲和力都有所不同，且这些差异不呈平行关系。TNF受体可分为2种，即TNFR和TNFR，两类TNFR均为糖蛋白，两类受体
5、胞外区域氨基酸序列相似度很高，但胞内区域那么完全不同。由于各种细胞表达TNFR存在差异，使得TNF对各种细胞的作用不同，一般来说，受体数目越高越容易受到TNF的损伤。TNFR还存在2种可溶性形式，为从细胞膜上通过蛋白酶水解下来的受体片段。它们通过与TNF结合而影响TNFR和TNF的功能及其含量变化，且影响效果是显著的。采用外表等离子体共振技术研究说明，TNF与其可溶性受体的亲和常数远高于一般的抗原与抗体结合的亲和力8。4 TNF的生物学活性 TNF在体内、体外均能杀死某些肿瘤细胞，或抑制其增殖作用。TNF杀伤肿瘤的机理还不十分清楚，与补体或穿孔素杀伤细胞相比，TNF杀伤细胞没有穿孔现象，而且杀
6、伤过程相比照拟缓慢。TNF能够增加过氧化物阴离子产生，增强ADCC功能，刺激细胞脱颗粒和分泌髓过氧化物酶，促进中性粒细胞粘附到内皮细胞上，从而刺激机体局部炎症反响。TNF促进T细胞MHC类抗原表达，增强IL-2依赖的胸腺细胞、T细胞增殖能力，促进IL-2、CSF和IFN-等淋巴因子的产生，增强有丝分裂原或外来抗原刺激B细胞的增殖和Ig分泌。5 TNF与临床 TNF是目前发现的抗肿瘤活性最强的细胞因子。在许多疾病，如心血管疾病、恶病质和败血症休克所致的多器官功能衰竭、类风湿性关节炎、多发性硬化症、炎症性肠病、移植物抗宿主病和骨髓造血紊乱综合症等的病理生理过程中起着重要的作用9。TNF除了对肿瘤细
7、胞本身具有细胞毒性之外，它也能摧毁实体瘤周围的血管上皮组织，并且通过血栓的形成，阻断肿瘤的血液营养供给，最终导致肿瘤的出血性坏死、消退或消失。超过一定浓度的TNF具有明显的抗新生血管形成作用。TNF能明显降低实体瘤周围间隙组织的压力，扩大肿瘤周围上皮组织的间隙，改变周围血管的通透性，使化疗的药物到达靶组织周围。另外，TNF通过对人体免疫系统的调节从而加强自身的抗肿瘤作用。TNF导致的心肌机能障碍包括钙平衡的改变、直接的细胞毒作用、氧化张力、兴奋-收缩耦联破坏、心肌细胞凋亡等。研究说明，严重的充血性心力衰竭、心肌梗死、心肌炎、扩张性心肌病、心脏移植排斥反响和进行心肺旁路手术患者的血浆TNF水平显
8、著升高。6 TNF的制备常用制备TNF的方法有体内法、体外法和基因工程法。体内法将卡介苗和LPS注入实验动物体内，诱导体内TNF的产生。外周血单个核细胞在重组白介素-2和有丝分裂原刺激下，或在十四酰沸波乙酸酯和LPS作用下均能产生TNF，此法可在体外大量收集细胞培养物，实现批量生产。分子生物学技术的应用，极大的促进了人TNF的制备工作。人TNF的氨基酸序列已弄清楚，并克隆出编码TNF蛋白质的cDNA。利用基因工程法可获得高活性、高纯度的TNF。基因工程法制备1) 改造TNF的分子结构分析hTNF的空间结构是研究新型hTNF的前提。具有生物活性的hTNF其空间结构是3个TNF单体以边对面形式形成
9、的近似三角锥形的三聚体，结构与功能研究说明，删去N端前7个氨基酸残基不影响hTNF三聚体空间结构。相反，在删去N端7个氨基酸的同时增加N端的碱性氨基酸，可以增强形成活性三聚体的能力，从而提高hTNF的抗肿瘤活性10。何晓龙等11构建了3种hTNF的衍生物。这三种衍生物比以往报道的单独缺失N端氨基酸或单独增强N端碱性氨基酸引起的活性升高要大得多，说明两种突变在提高TNF的细胞毒活性方面具有协同作用，具有潜在的临床应用前景。2) 制备TNF融合蛋白1. 具有TNF抗肿瘤活性和靶细胞专一性的融合蛋白借助于细胞因子与其受体的特异性，hTNF融合蛋白可以导向杀伤那些表达受体的肿瘤细胞。刘丽等12针对TN
10、F在肿瘤治疗剂量下产生的严重毒副作用及一些肿瘤细胞白介素-6受体明显增高的事实，采用PCR技术将TNF突变体与人IL-6成熟肽链编码区cDNA通过人工接头进行融合，并将融合的蛋白在大肠杆菌中表达，经活性检测结果证实，该融合蛋白在具有TNF的对L929细胞和人骨髓瘤细胞的细胞毒作用和结合IL-6受体的能力，在高表达IL-6受体的人骨髓瘤细胞上测得的细胞毒活性教同样位点突变的TNF高约3倍。国内比拟成功的例子是抗肝癌单链抗体融合TNF的双功能抗体。陈波等13将hTNF同带有肝细胞特异结合位点的乙肝病毒外表抗原pre(1-65)肽段进行融合表达，并在融合蛋白之间参加了连接肽段或凝血酶酶切位点，获得了
11、TNF与preS1融合蛋白的表达产物，该产物具有TNF的对L929细胞的细胞毒活性。2. 具有双重活性的融合蛋白构建融合蛋白不仅要考虑其靶向性，还要增加其功能。IL-2和TNF是引人注目的抗肿瘤活性因子，两者在抗肿瘤及免疫调节方面具有协同作用。颜世庆等14利用逆转录病毒载体构建了包括编码IL-2前导肽和TNF成熟肽序列的融合基因，表达的融合基因产物在体内和体外都对肿瘤细胞的生成具有抑制作用。高长寿等15将人降钙素基因相关肽与hTNF高效融合表达，表达的融合蛋白既有CGRP的结合活性，又有hTNF的活性。7 检测方法生物学检测方法：常用TNF对肿瘤细胞的细胞毒作用的强弱来判断它的活性。检测TNF
12、对靶细胞的细胞毒作用的指标主要有:胎盼兰活细胞计数法,中性红细胞摄入法,结晶紫染色法,MTT法，荧光素标记法等。免疫学检测方法:免疫学检测主要是根据TNF分子本身具有抗原性的特点,与抗TNF 抗体发生特异性结合,具有较高的灵敏度和特异性。与生物学检测相比,免疫学检测方法由于不需要进行细胞培养,从而大大简化了操作过程,使得临床检测TNF成为可能。近几年基因工程的迅速开展，也为免疫学检测方法提供了大量高纯度的TNF标准品。8 结语 TNF是由激活的单核细胞、巨噬细胞产生的一种具有多种生物活性的多肽细胞因子，与机体免疫反响、急性期反响及炎症反响关系密切，它可通过激活细胞因子网络系统而诱发全身炎性反响
13、，导致血液动力学改变、心肌抑制、微血管损伤及急性肺间质损伤等。运用正确适当的抗TNF治疗将可能成为一种新的治疗疾病的方法，但其临床应用价值还有待于进一步的证实。参考文献1 Nedwin GE，Naylor SL，Sakaguchi AY，et al. Human lymphotoxin and chromosomal localization. Nucleic Acids Res，1985，13：63612 Kapadia S ，Lee J,Torre-Amione G ,et al. Tumor necrosis factor alpha gene and protein experissi
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