细胞实验步骤

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1、细胞实验步骤细胞实验步骤一实验准备工作1材料和试剂_0培养基：美国Gibco公司；胎牛血清：Hyclone公司；佛波酯（PMA）： sigma公司；MTT： Biomol 分装；二甲基亚砜（DMSO）： sigma公司；磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾、氯化钠、碳酸氢钠（分 析纯）：细胞因子测定ELISA试剂盒：硫酸铜、重铭酸钾、浓硫酸、单蒸水、三蒸水、医用酒精2主要仪器与设备24、96孔细胞培养板：coning公司多功能酶标仪移液器超净工作台CO2细胞培养箱过滤器电子天平恒温振荡培养箱台式低速离心机恒温水浴箱冰箱（-20C。低温冰箱，-80C。超低温冰箱）显微镜、倒置显微镜细胞计数器一次性培养

2、瓶高压灭菌锅干燥箱3主要试剂配制（1）10xPBS缓冲液:称取氯化钠80g，磷酸氢二钠28.64g， 氯化钾2.25g，磷酸二氢钾2.05g于烧杯内，加入一定量的三蒸 水使其溶液，最后用容量瓶定容至1L。控制其PH值在7.2-7.4 之间。若出现未完全溶解，60C水浴助溶。再过滤（0.22um微 孔滤膜过滤除菌）备用。临用前稀释10倍，制成1xPBS，高压 灭菌后4C。保存备用。（2）MTT溶液：称取50mg MTT粉末放入小玻璃瓶中，加 10ml 1xPBS，60C水浴或超声助溶，用0.22um微孔滤膜过滤除菌，置于4C 冰箱中避光保存，两周内有效。清洁液（酸缸）配制：按重铭酸钾120g，浓

3、硫酸200ml，蒸 馏水1000ml比例配制。二细胞培养1 .实验所需器械及其准备1ml玻璃吸管，烧杯，培养瓶，10ml离心管，2ml、1.5ml、 0.5mlEP管，冻存管、0.22um微孔滤器，锡纸，封口膜，多孔培 养板（24孔，96孔），移液器，橡胶吸头，酒精灯，75%酒精， 注射器，黑色塑料袋，饭盒，试管架，量筒，容量瓶等。2. THP-1的培养试剂：_0，胎牛血清（Hyclone），佛波酯（PMA），DMSOTHP-1细胞的特性：（1）THP-1细胞是悬浮细胞；适合在偏 酸的环境中生长。，但也不能让培养基的酸度太重。（2）一般不要频繁换液，2-3次换液离心一次（只需要中 间补充培养基

4、）。（3）该细胞特别依赖细胞浓度，ATCC上提及细胞浓度在5*105-106 个/ml，生长比较快。（4）一般状态不好时，培养三天后细胞数量仍然不多， 继续培养一天或两天，培养基严重泛黄，细胞数量剧增。（5）还要注意，传代后切忌常移出培养箱观察，否则会影响细胞生长。（6）冻存时密度大一些，最好用血清冻存（90%的血清+ 10%DMSO）。（7）细胞密度较低时，换液后第二天细胞开始抱团，成 小或大葡萄串（“克隆体”）状生长，我自己觉得这时细胞状态还不错，待生长两三天后，细胞密度变大，自然就会成单个生 长了。但是值得注意的是：当细胞密度过高时，细胞呈单个生长， 部分细胞形态就会有变化，有伸出小突出

5、的（像小伪足），可能 是细胞被挤到，因此形态发生变化，换液传代后，将细胞密度调 低，生长一两天，细胞形态又恢复正常了。细胞步骤：（1）观察：肉眼观察（培养液颜色，清澈度，内 容物）：细胞状态好时，培养液澄清，细胞密度低时，培养基偏橙 色，培养液得3天左右才变黄，若细胞密度高，一两天培养液就 变黄，当密度很高时，培养液有一点点混浊感，变黄，这时由于 细胞过多而不是污染。这些情况下基本就可传代了。当细胞状态不好时，培养液有混浊感，不变黄，可再观察两 天，若还没有明显的变化，就丢弃。镜下（细胞大小形态，透光 度，细胞膜，细胞浆，抱团现象）观察：细胞悬浮，透亮，细胞 大小基本均一，也有“大个子”的细胞

6、（细胞膜完整，不是细胞肿 胀，而是处于分裂前期的细胞），或葡萄串状的，形态规则，呈圆 形，细胞膜完整，胞浆清澈。细胞密度较低时，可以见到一簇一 簇的细胞群，呈葡萄串状生长，此时可放到培养箱继续培养1-2 天再传代。当细胞密度较高时，细胞呈单个生长，在培养液中细 胞层层排列，微调显微镜，可明显看到细胞分布在培养液的每一 层，此时细胞须进行传代，否则细胞密度高了会影响细胞的状态。（2）细胞传代：当培养瓶中细胞培养液10ml时，可直接向 培养瓶中加入新鲜培养基，然后继续放入培养箱中培养。若培养 瓶中细胞培养液接近10ml，用玻璃吸管吹打混匀细胞，转入10ml 离心管中，1000r/min，5min，

7、可看到细胞团块，弃上清，加入 3-4ml新鲜完全培养液（_0+10%胎牛血清），吹打混匀细胞，按 1： 21： 4比例传代。细胞冻存（缓慢冷冻）：（1）一定要选生长状态好（形态规 则，透亮的细胞）的细胞，若细胞密度不高，则3瓶冻一管；若 细胞密度较高，则2瓶细胞冻一管。（2）在冻存前一天最好换一次培养液。（3）用玻璃吸管吹打混匀细胞，收集于10ml离心管中，离 心 1000r/min，5min。（4）配制冻存培养液:按冻存的管数配制相应量的冻存液。有是两个培养瓶的细胞冻一管，则在一个新的离心管中配制 400ul胎牛血清+100ulDMSO，混匀，备用。（5）细胞离心后，弃去上清（尽量将上清液弃

8、尽），加入500ul 的胎牛血清，混匀细胞，转入另外一个有细胞团块的离心管中， 混匀。（6）将配置好的冻存培养液缓慢加入细胞悬液中，吹打混匀，转入2ml的冻存管中。（这样的冻存步骤主要是为了减少 DMSO散热对细胞产生的影响）冻存管的盖子一定要旋紧。（8）冻存管上写明细胞的名称，冻存时间，冻存人的姓名， 冻存的管数号。用封口膜将瓶口封住。（7）细胞冻存程序降温：将标记好的冻存管放入 4C。，30min-20C，50-60min80C。（从-20C取出来转入-80C之前，需用棉花包住冻存管，减少外界温度对细胞的影响）（8）在实验记录本上记录冻存记录，包括冻存时间，冻存 时细胞状态，多少培养瓶的细

9、胞合并冻于一个冻存管，做的什么标 记，冻存的管数，在-80C冰箱中存放处。（9）注意：细胞状态不好时（长的太过，培养液已经很黄； 细胞可疑污染；细胞已经开始凋亡或崩解；连续培养超过两个月， 细胞性状可能会改变）最好不要冻细胞；冻存的最佳时期：细胞 增殖旺盛，情况稳定，试验效果良好，复苏后两周内）细胞复苏（快速融化）：（1）找到需要复苏的细胞在-80C冰 箱的位置，以便取细胞。（2）水浴箱设定温度37-39C。（3）在超净台内事先准备好9ml_0于10ml离心管中备用 稀释解冻的细胞悬液。（4）从-80C。的超低温冰箱中取出冻存管，检查瓶盖的松紧，并将其旋紧，立即放入准备的盛有37-39C温水的

10、 小烧杯中，再转入水浴箱中轻轻晃动使其在1分钟内完全溶解 （动作幅度不要太大，否则溶液将水浴箱中的水溅到冻存管口， 容易引起污染。）用75%的酒精擦拭冻存管外部及管口，移入无菌 操作台内。（5）冻存管口在酒精灯上过火后，用吸管吸出细胞线业，并缓缓注入事先准备的9ml_0中，混匀。离心，1000r/min， 5min。弃上清，加入3-4ml _0+20%胎牛血清，混匀，按1： 2或 1： 3转入培养瓶内，再注入一定量的新鲜_0+20%胎牛血清。（6）镜下观察细胞，记录细胞状态及密度，放入培养箱中培养。2天后换液或传代。这次仍然用20%的胎牛血清 培养。在这之后可换成10%的胎牛血清培养。（7）只要冻存工作完成的好，复苏大多没有困难，但是要 有耐心。