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1、单分子荧光检测技术 single molecules fluorescence detection一、4 -A一冃u g统计力学的各态遍历假设(Ergodic Hypothesis): 系综个体物理量轨迹的时间平均等于该物理量在给定时 间的系综平均在包含完全相同个体的系综，测量时间足够长“系综测量和单分子测量结果在均相体系：测量时间可能小于涨落时间非均相体系：个体轨迹平均不等于系综平均“ 系综测量和单分子测量结果显微镜的发展光学显微镜电子显微镜扫描隧道显微镜扫描探针显微技术和光学技术连用近代，随着各个学科的发展，科学研究达到了微观分 子水平，使得我们可以看清单个分子与时间相关的行 为,排除测量
2、中的平均效应单分子检测实验的重要性:旷对非均相体系，可给出分子性质的分布信息旷对均相和非均相体系，单分子轨迹即是 分子性质涨落的直接记录，蕴涵丰富的动力学知识单分子检测技术扫描探针显微技术 (Scanning Probe 4 Microscopy)光学和光谱技术扫描隧道显微技术(STM)原子力显微技术(A FN1)扫描离子电导显微技术(SICM)扫描近场光学显微技术(SNOM)光钳技术(Optical Fweezer)荧 光技术(Fluorescence)单分子荧光检测原理1.单分子荧光检测是单分子检测最常用的 方法矗 标记在生物大分子上各个荧光基团的各种特 性的变化反映了有关分子间相互作用、
3、酶活 性、反应动力学、构象动力学、分子运动自 由度及在化学和静电环境下活性改变的信息義对宿主影响小疇 稀溶液中荧光发射检测较为灵敏，背景值较 低，信噪比高2 单分子荧光产生原理Sz i $Vibrational relax, VR, 10-121014 sInternal conversion, IC? IO41 1 (N sIntersystem crossing, ISC, lO lO 6 sJablonski Diagram3 单分子荧光的特征回量子跳跃特性发射一暗态交替的量子跳跃过程是单分子荧 光的主要特征之一，取决于单分子的周围环境 和猝灭途径，是实验中单分子荧光光谱和荧光 强度涨落
4、现象的原因同荧光偏振特性单分子荧光分子具有唯一的固定吸收和发 射偶极矩，因此在偏振激光的激发下，通过测 量单个分子的吸收和荧光的偏振方向，可以 全确定单个荧光分子的空间取向。这是单分 荧光的主要特征之二4 单分子荧光探测的技术关键在被照射的体积中只有一个分子与激光发生 相互作用（调整研究体系的浓度或密度）A确保单分子的信号大于背景干扰信号（有效 减少拉曼散射、瑞利散射及其杂质荧光所造 成的干扰）5 单分子荧光检测的应用11单分子荧光寿命5M ATP40 删 ATPat5pM O) and 40pM (b ATP (F 1 “d SuppT妙Ury niorTVrt.nn) DaRTAd Of
5、are W eeonmaai 他 sctd ctifvea represerr 帕 acoai rioia two-siep m* (opiatncKim rrvtrOtgrtpr刃 bar勾 n a and b aijer rw titwj 5 racvd aM ncorporates axial 妙amuMhai (9txm30*nl&NATURE 422 (6930): 399-404 MAR 27 2003ATPcxncaritrstxxinFracton nfhtpe3ihiia%KCM 1 ODAX0103KL0934.413.6n.7 1.112.437.31124CMmnj10
6、00.48 0D327.1 0J8.20.6311.47L81313.1 15X41215崗80口他48-52 C.54j6CJ44.9fl.C4CiiMnanHimq101-MJ0.Z620J41.9ejDM140C.4210M26J61CJ54.78*0.636.17.651J 0.97AxU46.46.C3单分子荧光共振能量转移荧光共振能量转移原理 当能量给体分子(D)和受体分子(A)相隔的距离远大于D-A碰撞直径时，如若D的发射谱与A的 吸收光谱发生重叠，且距离在有效范围内，能量就 可以从短波长的荧光基团D传递到长波长的荧光基 团A,这个过程称为，实际相当于将短波长荧光基团D释放的荧光
7、屏蔽 这是一种通,过偶极一偶极耦合作用的能量转移过程。单分子即是在一个生物大分子或两个相互作用的分子上标记两个不同的荧 光基团，作为能量的供体和受体a)W 丹6 ntnh 37RETf /KMat ”d nmOMFXE r ZZHYfT通过检测能量在供.给体之间的转移效率，可 确定两点间距离的变化。依据其距离变化随时 间的改变关系则可推测生物大分子在生命活动 中（eg催化，折叠）构象变化的所引起的两 点间距离的变化，得到动力学过程Chem. Commun., 2004, 496-497小结单分子荧光检测可提供有别于分子聚积 态的单个分子的特殊局域环境、分子涨 落、生物大分子的柔性及其运动等有价 值的信息该技术在实现和应用上投入相对较少单分子荧光检测是研究单分子最灵敏、最 简便的方法之一/
