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1、目的基因（COR）转入细菌细胞的方法及其检测XXX（XXX农业与生物技术学院，XXX XXX， XXX）摘要：以PGEM-T-easy质粒为载体，将氨苄青霉素抗性基因导入大肠杆菌，通过含有氨苄青霉素的培养基筛选出具有氨苄青霉素抗性基因的大肠杆菌，对筛选出的大肠杆菌进行质粒DNA提取,并对质粒进行PCR扩增和酶切，将产物进行琼脂糖凝胶电泳图谱分析。结果表明：氨苄青霉素抗性基因被导入大肠杆菌中并在大肠杆菌中得到表达。关键字：PCR扩增 氨苄青霉素 抗性基因 大肠杆菌 引言：随着生物科技的飞速发展，越来越多的生物技术被广泛的应用于各类应用领域。如PCR技术、基因重组、DNA连接等等已被人们广泛的应用
2、于生物体内基因的扩增及新的生物性状的研究。然而，对于氨苄青霉素抗性基因在大肠杆菌染色体上整合及表达尚未见研究。本研究借助于PCR、DNA连接转化、琼脂糖凝胶电泳对氨苄青霉素抗性基因在大肠杆菌染色体上整合及表达进行了研究。旨在为氨苄青霉素抗性基因在大肠杆菌染色体上整合及表达提供一定的理论依据。1 材料和方法1.1 试剂与器材1.1.1 材料试剂：大肠杆菌；PGEM-T-easy质粒；Taq酶；引物(正向、反向；10umol/ml)；模板DNA；10RCRbuffer；ddH2O；dNTP（2.5mol/L）；T4DNAligase；Cacl2（0.1mol/L）；LB培养基；氨苄青霉素（50mg
3、/ml）；溶液（葡萄糖，50mmol/L；Tris-HCl，25mmol/L；EDTA，10 mmol/L）；溶液（0.4mol/LNaOH和2%SDS用前等体积混合）；溶液（5mol/L乙酸钾，60ml；冰醋酸，11.5ml；水，28.5ml）；TE缓冲液（pH8.0）；0.5mol/LEDTA；70%乙醇；氯仿：异戊醇（V:V，24：1）；Tris饱和酚：氯仿：异戊醇（V:V：V，24：24：1）；琼脂糖。1.1.2 器材：PCR扩增仪；移液枪；电泳仪；紫外检测仪；恒温摇床；恒温水浴器；恒温培养箱；低温离心机；超净工作台；冰箱；离心管；小指管；酒精灯；牙签；培养皿、试管若干。 1.2 方法
4、1.2.1 PCR基因扩增1.2.1.1 加样： 在PCR管中加入ddH2O(35l)； DNA 样品（1l）； 10PCR 缓冲液（5l）；2.1mmol/L dNTP （4l）； 正向引物（2l）； 反向引物（2l），振荡混匀。 1.2.1.2 PCR反应 (1) 94预变性 5min (2) 94变性 1min (3) 55退火 1min (4) 72 延伸 2min。 (5) 重复(2)-(4) 30次（6）72 延伸 10min。（7）4保存1.2.1.3 琼脂糖凝胶电泳检测PCR的结果：取10l PCR扩增产物，琼脂糖凝胶电泳检测。电泳结束后，用EB染色15min，紫外灯下观察。1
5、.2.2 DNA重组1.2.2.1 配制连接体系： T4 DNA ligase（1.0ul）；buffer（1.0ul）；PGEM-T-easy（0.5ul）；DNA（7.5ul） 将配制的连接体系保温过夜。 1.2.3大肠杆菌感受态细胞的制备及转化1.2.3.1从大肠杆菌平板上用镊子夹取牙签挑取一个单菌落接于3mlLB液体培养基试管中， 37振荡过夜。1.2.3.2将培养液1ml分装入1.5ml离心管中，在冰上冷却10-30min于4离心，4000r/min10min，弃去上清。1.2.3.3用冰浴的0.1mol/LCaCl2 20l悬浮细胞，立即放入冰上冰浴30min，0-4，4000r/
6、min离心10min。1.2.3.4弃去上清，加入冰浴的0.1mol/LCaCl2溶液200l悬浮细胞，立即放入冰上冰浴30min。4，4000r/min离心10min，弃去上清。1.2.3.5 弃去上清，加入冰浴的0.1mol/LCaCl2溶液100l悬浮细胞，即制成了感受态细胞。加入10ml连接体系，轻轻混匀，冰上放置30分钟。1.2.3.6于42水浴保温90s，迅速转移至冰浴中，冷却2min1.2.3.7立即向上述管中加0.8ml LB培养液，37振荡培养50min，使受体菌恢复生长状态，并使转化体表达抗生素基因产物。1.2.3.8取转化细胞200ul涂于含氨苄青霉素5mg/L的 LB固
7、体培养基平板上，37恒温培养8-12h。1.2.4质粒DNA的提取及酶切1.2.4.1 提取质粒1.2.4.1.1 根据LB固体培养基上生长的菌落，挑取单一菌种接种于2.0mlLB含抗生素的液体培养基，37震荡培养过夜。1.2.4.1.2 取1.5ml培养物倒入微量离心管中，室温4000r/min离心2min。1.2.4.1.3吸去上清液，将细胞悬浮于100l（5 mg/ml 溶菌酶）预冷的溶液，剧烈震荡使菌体悬浮，混合，室温放置10min。1.2.4.1.4加入200l新鲜配置的溶液，轻轻混匀，冰浴5 min。 1.2.4.1.5 加入150l的溶液，混匀，见絮状沉淀，冰浴5 分钟，1200
8、0r/min，离心15min，取上清。1.2.4.1.6 向上清液中加入450ul苯酚/氯仿/异戊醇混合物混匀，12000r/min离心10min。1.2.4.1.7 吸取上清液，加2倍体积预冷的无水乙醇，充分混匀，室温放置510min。4120000 r/min离心5 min。1.2.4.1.8 用400ul70乙醇洗涤质粒DNA沉淀2次，48000 r/min离心7 min，弃上清，将沉淀室温下晾干。1.2.4.1.9 加20ul TE 37水浴30min，使DNA完全溶解。1.2.4.1.10对质粒进行琼脂糖凝胶电泳。1.2.4.2 酶切取5ul DNA 溶液，EcoR （0.5ul），
9、Hbuffer（1.0ul），ddH2O(3ul),加入微量管中酶切1h，用移液枪加样进行凝胶电泳，分析质粒DNA的限制性酶切图谱。2 结果与分析2.1 PCR扩增目的基因的电泳图结果图1 PCR目的基因的扩增电泳图 图1中3泳道为PCR扩增后电泳结果条带，扩增DNA分子量为1000bp左右，这与目的基因相对分子质量相符，达到了目的基因的扩增。2.2 重组后的质粒导入大肠杆菌后的表达图2 转化成功的大肠杆菌菌落 图2中的白色菌落为重组后的质粒经转化导入大肠杆菌细胞，在含氨苄青霉素培养基上长出的具有氨苄青霉素抗性的菌落，说明目的基因导入细胞并且得到了表达。2.3质粒DNA的电泳图谱图3 质粒DN
10、A电泳图图3泳道3和7为本实验电泳泳道，泳道3经电泳后条带较暗淡，其显示出DNA长度大于2000bp，与所预期结果一致；而泳道7经电泳后没有出现条带，分析其原因可能是洗涤DNA过程中，由于移液枪使用不当，连其目的产物一起吸出，致使目的产物流失，而在电泳时没有出现条带。2.4 质粒酶切产物电泳结果图4 质粒酶切产物电泳结果 图4 中泳道3和7为本实验质粒酶切产物电泳结果，有图可以看出，质粒DNA经酶切后隐约的出现了一条大约750bp左右的条带，说明经酶切后，质粒DNA仅有部分被切开，而大多数没有被切开，其长度则显示的是长度大于2000bp的比较清晰的条带。分析其原因一方面可能是由于在进行酶切时酶
11、切的时间太短，另一方面则可能是酶的活性不够高，在一定的时间内无法达到质粒DNA的酶切位点完全被切开的目的。通过本实验，我们得到了具有氨苄青霉素抗性基因的大肠杆菌。参考文献 1 张惟材, 焦迎晖, 袁红杰, 等. 一种新的L-山梨糖脱氢酶基因及其编码的蛋白质. 中国专利, 申请号: 031020607 2 山梨糖脱氢酶基因在大肠杆菌染色体上整合及表达 高书颖；张惟材；汪建华；郭蔼光；（微生物学报 第45 卷第 1 期 2005 年2 月） 3大肠杆菌多重耐药调控基因soxS 的克隆及其原核表达 于晓颖, 刘玉堂, 丛薇, 刘树明, 马红霞 (中国兽医学报 2010年10 月 第30卷 第10期) 4 ret基因真核表达载体的构建及其瞬时表达 郭小兵 张钦宪 （Journal of Zhengzhou University (Medical Sciences) Sep. 2006 Vo.l 41 No. 5）5 韩聪, 张惟材, 游松 大肠杆菌ptsG 基因敲除及其缺陷株生长特性研究（ 生物工程学报, 2004, 20(1) : 16- 20）
