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1、.一、 免疫细胞化学技术的概述*免疫细胞化学(immunocytochemistry,ICC)-是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定细胞内抗原的成分(主要是多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫细胞化学。(一)对抗原和抗体的要求*具有特异性高和亲和力强的抗体是实验成功的首要条件。-对抗体的要求：纯度高、比活性强；*高度特异性抗体的获得，取决于抗原的纯度。-对抗原的要求：纯度高，免疫原性强，稳定无变化。(二)抗原(antigen,Ag)*抗原的概念：凡是在机体内引起体液免疫和(或)细胞免疫反应的物质，称为抗原
2、。抗原具有两个方面的特性：-免疫原性：引起机体产生抗体和(或)致敏淋细胞的特性；-免疫反应性：抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异的结合或反应的特性。*根据抗原是否显示免疫原性分为：完全抗原：分子量较大，一般在10kDa以上，并具有较复杂的化学组成。(免疫原性最强的是蛋白质抗原，多糖次之；脂类和核酸必需和蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性)半抗原：又称为不完全抗原，分子量较小。例如：某些短肽、多糖、类脂和药物等。(半抗原必需与载体结合，才能获得免疫原性)。载体通常是具有高度免疫原性的大分子物质，具有将免疫原性传递给耦联的半抗原能力。-常用的载体有钥孔血蓝蛋白(keyholelimp
3、ethemocyanin，KLH)、牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA)、卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)等。-用戊二醛或碳化二亚胺作为交联剂通过功能基团-NH2、-COOH等将半抗原结合到载体上。结合比例为5kDa结合525个分子的小肽。（三）抗体(antibody,Ab)1、抗体的概念：*机体受到抗原刺激后，由浆细胞合成并分泌出一类具有与抗原发生特异性结合的球蛋白，被称为抗体。-抗体主要存在于血清内；抗体都是免疫球蛋白，但免疫球蛋白并不一定都是抗体。-免疫球蛋白根据重链的结构及抗原特异性不同分为五种，既IgG、IgD、IgE、IgA、IgM。2、免疫组化实验中
4、常用的抗体：单克隆抗体和多克隆抗体。*单克隆抗体：是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，是应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备的。-特异性强、抗体产量高。*多克隆抗体：是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。-特异性低，会产生抗体的交叉反应。-多克隆抗体广泛应用于石蜡包埋组织切片，可减少假阴性染色机会。-抗原与抗体的结合，要求量保持一定比例，当抗原或抗体过量时，是不能聚合成大颗粒。3、抗体的制备多克隆抗体的制备*动物的选择*佐剂(adjuvant)*免疫方法*免疫剂量*抗体效价的测定*放血或定期抽血(1)动物的选择选择什么动物来免疫取决于：所
5、需抗血清的量:小鼠只能提供1.01.5ml的血液，而山羊能提供几升。能供免疫用的抗原量:小鼠50&61549;g足够，而山羊需要几毫克。动物的品系：免疫动物与提供抗原的动物之间的种系差异越大越好。例如哺乳动物的抗原可选择非哺乳动物来制备抗体。常用的动物有兔、羊、马、猪等，以兔(新西兰兔，年轻，健壮，体重在2.5kg左右，雄性)为最常用。(2)佐剂(adjuvant)*一般可溶性抗原注射后，迅速从注射部位扩散、吸收代谢。佐剂可延长潴留时间，且延长免疫刺激作用。因此在制备抗体的过程中，常将抗原和佐剂一起注射。*最常用的佐剂是弗氏佐剂，又分为弗氏不完全佐剂(Freundsincompleteadju
6、vant);弗氏完全佐剂(Freundscompleteadjuvant)弗氏不完全佐剂(Freundsincompleteadjuvant,FIA)是由油剂(石蜡油或植物油)与乳化剂(羊毛脂或Tween80)混合而成，比例为1:1、2:1、3:1或5:1，可根据需要而定，通常2:1。(使用时与水溶性抗原按1:1比例充分混合，使抗原分散在佐剂中形成油包水乳剂)弗氏完全佐剂(Freundscompleteadjuvant,FCA)是在弗氏不完全佐剂中加入活卡介苗或死的结核分枝杆菌(终浓度为220mg/ml)，即成为FCA。*免疫动物时，将弗氏佐剂与抗原按体积1:1混合乳化后(油包水)注入动物。-
7、一般首次注射时用完全佐剂乳化，第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。一.佐剂与抗原乳化的方法:*研磨法(适于制备大量的佐剂抗原)：先将不完全佐剂加热，取1.73ml放人无菌玻璃研钵内；缓缓滴入0.23ml活卡介苗,边滴边按同一方向研磨，使菌体完全分散。按同样方法滴人抗原，每加一滴应研磨至小滴消失。滴加抗原的速度要慢，待抗原全部加人后，应成为乳白色粘稠的油包水乳剂。缺点：研钵壁上粘附大量乳剂，抗原损失较大，对微量或难得抗原不宜采用。*注射器混合法:将等量的完全佐剂和抗原分别吸人两个5ml注射器内，然后插入三通管内,交替推动针管混匀，往复操作直至形成粘稠的乳剂为止。优点：无菌操作，节省抗原或
8、佐剂。缺点：不易乳化，时间长。*快速乳化法：利用超声波粉碎器可快速乳化抗原和佐剂混合物。-将抗原和佐剂按所需量加入一离心管中，置于超声波粉碎器上，粉碎头浸入液面下0.5cm，离瓶底0.5cm左右，以免打碎离心管。-每次乳化1015s，然后置冰箱lmin左右。反复乳化34次即可完全乳化。管内残余量800r/min离心510min收集。优点：简单、快速、节省材料。乳化剂的鉴定-判断乳化是否充分，可将一滴乳化好的液体滴在水面上(冷水中)，如能长时间保持圆珠形而不散开，表示乳化达到要求。(3)免疫方法免疫途径*常有静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内、淋巴结、脚掌等注射。*一般采用多点注射方法-常在足、掌、腋
9、窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等处的皮内或皮下。-皮内易引起细胞免疫反应，有利于提高抗体的效价。*几点说明：-大动物一般不用腹腔注射-颗粒抗原和使用佐剂时不能静脉注射-抗原宝贵可采用淋巴结内微量注射法，只需10100&61549;g抗原即可获得较好的免疫效果。-皮内注射较困难，特别是天冷时更难注入。(3)免疫方法次数及间隔时间*次数一般为23次(初次免疫和加强免疫)-首次注射后，1015天再加强注射；-剂量同首次或为首次的一半，用不全佐剂或不用佐剂。*间隔时间，一般而言，动物越大，间隔越长-豚鼠、大鼠为78天，兔子为1015天，羊为1428天；-第三次注射的间隔时间更长些，效果更好。举例1
10、：家兔的免疫*初次免疫-用50200&61549;gAg加入FCA，在背部皮下注射68点，每点0.10.2ml，也可肌肉内或皮内注射；*两周后，加强免疫-将50200&61549;gAg于PBS或FIA中，在肌肉、皮下、静脉或腹腔内注射；*抗体效价的检测：加强免疫一周后，耳缘静脉采血-抗体效价测定可用环状沉淀试验、琼脂双向扩散法等方法。前者抗体效价在1:4000以上，后者在1:16以上，即可采血，取血清进一步提纯。举例2：微量抗原淋巴结内注射免疫家兔*一般选择2.53.0kg的新西兰种公兔-先在其两脚垫注射完全福氏佐剂0.2ml(卡介苗每兔合5mg)；-10天后，见胭窝淋巴结肿大，然后将抗原注
11、射至肿大的淋巴结内，第一次注射抗原用完全福氏佐剂混合乳化；-以后每隔20天用不完全福氏佐剂乳化抗原，以同样方法加强2次，各次注射的抗原均为2550&61549;g；-末次注射两周后兔耳放血测价(可达1:128)。举例3：豚鼠和大鼠的免疫*初次免疫-用10100&61549;gAg加入FCA，在背部皮内注射46点，每点0.lml，也可肌肉内或皮下注射；*加强免疫-每隔78天，将1050&61549;gAg于PBS或FIA中。在肌肉、皮下或静脉注射；(4)免疫剂量*抗原性强的抗原量应小，过大反会引起免疫抑制；*免疫周期长的动物可少量多次注射，短的可大量少次。*各种动物首次免疫抗原剂量和加强免疫的剂
12、量(5)抗体效价的检测多采免疫双向扩散法一【基本原理】*指抗原和抗体在同一凝胶内都扩散，彼此相遇后形成特异性的沉淀线。-将抗原与抗体分别加入同一凝胶板中两个相隔一定间距的小孔内，使两者进行相互扩散，当抗原抗体浓度之比相适宜时，彼此相遇形成一白色弧状沉淀线。*优缺点：简便，但敏感性较低，易出现假阴性结果。1.免疫双向扩散法的操作步骤:*将玻璃板用水洗净后用75乙醇冲洗，晾干后放在水平台上备用。*将1agar融化后，置56水浴。*在玻璃板上铺胶，约1.5mm厚，凝固后打孔(直径3rnm)，孔间距10mm。*中心孔加5&61549;l抗原样品，周围孔内每孔加5&61549;l抗血清(抗体预先作系列倍
13、比稀释即1:2、1:4、1:8、1:16、1:32等比例)。*凝胶板置湿盒内，室温扩散24h。*观察结果。2.抗体效价检测的其它方法*环状沉淀试验，需较多的抗血清，现已很少用；*对流免疫电泳，比琼脂免疫双扩散法敏感，较简便、实用；*酶联免疫吸附试验(ELISA)。3放血或定期抽血常用以下3种方法*颈动脉放血法：放血量较多，动物不易中途死亡。例如：2.5kg白兔可放血约80ml。家兔、山羊、绵羊等动物采血常用此法。*心脏采血法：常用于家兔、豚鼠、大白鼠、鸡等小动物，但操作不当易引起动物死亡。*静脉采血：家兔可用耳缘静脉采血；山羊、绵羊、马和驴可用颈静脉采血，这种放血法可隔日1次，有时可采集多量血
14、液。注意:采血过程中，动作要轻柔，尽量避免溶血;血液凝固后，及时离心收集血清，否则细胞溶解释放的杂蛋白(例如蛋白水解酶)将污染抗体并将抗体水解，降低效价；加叠氮化钠，分装，低温保存，也可加一定的保护剂如BSA、甘油等。二、组织和细胞标本的制备*标本制备恰当，是免疫组化成功的首要条件*免疫组化对组织和细胞标本的要求-保持所检标本原有的结构、形态；-在原位最大程度地保持待测抗原(或抗体)的免疫活性，既不淬灭、流失或弥散，也不被隐蔽。*免疫组化的组织和细胞标本，制作流程与常规处理方法基本相同，但对组织、细胞的处理又有其特殊要求及注意事项。-各种抗原由于其含量及特性的差异对标本处理方式常有不同要求，因
15、此要选择适用于本实验的最佳方法。免疫组化中常用的组织和细胞标本*组织标本-石蜡切片-冰冻切片*细胞标本-组织印片-细胞培养片(细胞爬片)-细胞涂片(一)石蜡切片*石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法-最大优点是组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；-石蜡块还能长期存档，供回顾研究。*石蜡切片制作过程对组织内抗原显现有一定的影响，但可通过某些措施予以改善，因而它是大多数免疫组化中首选的组织标本制作方法。1、取材的特殊要求及注意事项*标本新鲜：一般在2h以内进行，超过2h，组织将有不同程度的自溶，其抗原或变性消失，或严重弥散。*取材部位：除取病灶或含待检抗原部位外，还应取病灶与正常交界处，即所取组织切片中同时应有抗原阳性和阴性区，以形成自身对照。-细胞坏死后，不仅抗原弥散或消失，而且常引起非特异着色，干扰观察，因此取材时应尽可能避开坏死区。*避免挤压：取材时组织受挤压可使边缘部细胞形态改变并加深非特异着色，因而取材时应使用锋利的刀刃；镊取组织动作要轻；经窥镜直接钳取的组织往往有过度挤压，观察结果时应有所考虑。2、固定及常用的固定液*取材后的组织需立刻投于固定剂中-固定使组织和细胞的蛋白质凝固，终止内源性或外源性酶反应，防止组织自溶或异溶，以保持原有结构和形态；对免疫组化而言
