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1、细菌芽孢染色及酵母菌的观察 - 山东大学山东大学实验报告2011年11月2日姓名*班级*学号*同组 者： *科目微生物学实验题目细菌芽孢染色及酵母菌的观察组别*细菌芽孢染色及酵母菌的观察【实验目的】1. 学习芽孢染色法，了解芽孢的形态特征；2. 观察酵母形态及出芽方式，区分酵母菌的死活细胞；3. 学习酵母子囊孢子的观察方法。【实验原理】A、细菌芽孢染色的基本原理芽孢是芽孢杆菌属和梭菌属细菌生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构， 也被称为内生孢子，通常呈圆形或椭圆形。 细菌能否形成芽孢及芽孢的形状，着生位置、芽孢囊是否膨大等特征都是鉴定细菌的重要指标。与正常细胞或菌体相比，芽孢壁厚、透
2、性低而不易着色，但是芽孢一旦着色就很难被脱色。利用这一特点，首先用着色能力较强的染料，如孔雀绿，在加热条件下进行染色时，此染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出。再用对比度大的复染剂（如番红第 2页 共 19页微生物实验报告*山东大学实验报告2011年11月2日姓名*班级*学号*同组 者： *科目微生物学实验题目细菌芽孢染色及酵母菌的观察组别*液）染色后，菌体染上复染剂颜色，而芽孢仍为原来的颜色，这样就可以将两者区别开来。在不同细菌中， 芽孢所处的位置不同， 有的在中部，有的在偏端，有的在顶端。芽孢一般呈圆形、椭圆形、圆柱形。常见的细菌
3、芽孢形态和着生位置如下图所示：B、酵母菌形态及出芽方式观察的基本原理酵母菌是一群单细胞的真核微生物。这个词语也是无分类学意义的普通名称，通常用于以裂殖或芽殖来进行无性繁殖的各种单细胞真菌。由于不同的酵母菌在进化和分类地位上的异源性，因此很难对酵母菌下一个确切的定义，通常认为，酵母菌具有以下 5 个特点：个体一般以单细胞状态存在；多数营出芽繁殖；能发酵糖类产能；细胞壁常含甘露聚糖；常生活在含糖第 3页 共 19页微生物实验报告*山东大学实验报告2011年11月2日姓名*班级*学号*同组 者： *科目微生物学实验题目细菌芽孢染色及酵母菌的观察组别*类较高、酸度较大的水生环境中。单细胞的酵母菌个体是
4、常见细菌的几倍甚至几十倍，可在 40 倍显微镜下经过简单染色直接观察。酵母菌大多数采取出芽方式进行无性繁殖，也可以通过结合产生子囊孢子，进行有性繁殖。由于细胞个体大，采取涂片的方法制片有可能损伤细胞，一般通过美蓝染液水浸片法来观察酵母菌活体形态及出芽生殖方式。出芽繁殖是酵母菌进行无性繁殖的主要方式。成熟的酵母菌细胞，先长出一个小芽，芽细胞长到一定程度，脱离母细胞继续生长，尔后形成新个体。有多边出芽、两端出芽、和三边出芽。第 4页 共 19页微生物实验报告*山东大学实验报告2011年11月2日姓名*班级*学号*同组 者： *科目微生物学实验题目细菌芽孢染色及酵母菌的观察组别*酵母菌不同类同时，采
5、用美蓝染液水浸片法还可以对酵母菌的死、活细胞进行鉴别。美蓝对细胞无毒，其氧化型呈蓝色，还原型无色。由于新陈代谢，活细胞胞内有较强还原能力，使美蓝由蓝色氧化型变成无色的还原型，染色后活细胞呈无色。死细胞或代谢能力微弱的衰老细胞还原能力弱，染色后细胞呈蓝色或淡蓝色。C、酵母菌子囊孢子观察的基本原理子囊类酵母菌是以接合产生形成子囊和子囊孢子的方式进行有性繁殖的。它们一般通过邻近的两个形态相同而性别不同的细胞各自伸出一根管状的原生质突起相互接触、局部融合并形成一条通道，再通过质、核配和减数分裂形成 4 或 8 个子核，然后它们各自与周围的原生质结合在一起，再在其表面形成一层孢子壁，这些一个个子囊孢子就
6、成熟了， 而原有的营养细胞则成了子囊。能否形成子囊孢子及其形态是酵母菌分类鉴定的重要依据之一。酵母菌形成子囊孢子需一定条件，其中麦氏培第 5页 共 19页微生物实验报告*山东大学实验报告2011年11月2日姓名*班级*学号*同组 者： *科目微生物学实验题目细菌芽孢染色及酵母菌的观察组别*养基有利于酿酒酵母子囊孢子的形成。孢子壁厚不易着色，但是一旦着色就很难被脱色。因此先用强染色剂（孔雀绿）下染色，使染料进入菌体和孢子，水洗时菌体中染色被洗脱而孢子中染料保留。在用对比度大的复染色剂染色后，菌体染上复染色剂的颜色而孢子保留原来颜色，这样可将两者区别开来。【实验器材】1、 菌种：枯草芽孢杆菌， 梭
7、状芽孢杆菌 , 酿酒酵母 7d 麦氏（产孢培养基）液体培养物，酿酒酵母斜面培养物。2、 溶液和试剂：a) 0.01%美蓝水溶液， 5%孔雀绿水溶液， 0.5%番红水溶液， 95%乙醇，蒸馏水等。b) 香柏油、二甲苯3、 仪器及其它用品：普通光学显微镜、擦镜纸、绸布、酒精灯、载玻片、接种针、培养皿等【操作步骤】第 6页 共 19页微生物实验报告*山东大学实验报告2011年11月2日姓名*班级*学号*同组 者： *科目微生物学实验题目细菌芽孢染色及酵母菌的观察组别*A. 细菌芽孢染色的基本原理1. 实验流程图：涂片加热干燥固定孔雀绿覆盖2. 详细步骤：a) 涂片，加热干燥及固定番红水洗复染水洗冷却
8、干燥微热5min镜检在洁净盖玻片接近中部两处分别滴一滴无菌水，分别接种枯草芽孢杆菌及梭状芽孢杆菌。然后按照常规方法加热干燥及固定；b) 孔雀绿加热染色用木夹夹住载玻片，向载玻片上滴加 5%孔雀绿水溶液使之完全覆盖涂菌部位，然后在酒精灯上微微加热（孔雀绿着色能力强，加热可使较难染色的芽孢染成绿色，且再难洗脱）至染液冒蒸汽开始计时并维持5min，注意加热时应以有蒸汽微微冒出为宜，过热或第 7页 共 19页微生物实验报告*山东大学实验报告2011年11月2日姓名*班级*学号*同组 者： *科目微生物学实验题目细菌芽孢染色及酵母菌的观察组别*加热不足均会影响观察效果，且加热时在载玻片上随时补加染液，切
9、勿让涂片干涸；c) 水洗水洗一定要等载玻片冷却后进行，否则可能导致载玻片的破裂。具体水洗按常规方法进行；d) 复染用 0.5%番红水溶液复染 2min；e) 水洗并干燥按常规方法水洗后自然干燥；f) 镜检先在低倍镜下寻找视野范围，然后换用高倍镜调焦，最后加香柏油在油镜下仔细寻找两种细菌以及其周围或内部染成绿色的芽孢。B. 酵母菌形态及出芽方式观察的基本原理1. 实验流程图：滴加加盖镜检接种玻片放置美兰2. 详细步骤：a) 涂片第 8页 共 19页微生物实验报告*山东大学实验报告2011年11月2日姓名*班级*学号*同组 者： *科目微生物学实验题目细菌芽孢染色及酵母菌的观察组别*在洁净盖玻片中
10、部滴一滴 0.01%美蓝水溶液， 按常规方法接种酵母b) 加盖玻片加盖玻片时首先使盖玻片的一端接触载玻片上的液滴的一端，然后再将另一端缓缓放下，目的是防止气泡的产生，以免影响观察；c) 放置及镜检从接种开始计时，放置 3min，然后在高倍镜（ 40）下观察酵母菌的形态，根据染色状态判断酵母菌的死活（由于新陈代谢，活细胞胞内有较强还原能力，使美蓝由蓝色氧化型变成无色的还原型，染色后活细胞呈无色。死细胞或代谢能力微弱的衰老细胞还原能力弱，染色后细胞呈蓝色或淡蓝色） ，寻找并观察酵母菌不同类型的出芽方式（一端出芽或两端出芽）。将酵母菌美兰浸片放置 30min，再用高倍镜（ 40）观察，根据染色状态判断酵母菌的死活，并与 3min 时的情况做一对比说明。C. 酵母菌子囊孢子的观察1. 实验流程图：第 9页 共 19页微生物实验报告*山东大学实验报告2011年11月2日姓名*班级*学号*同组 者： *科目微生物学实验题目细菌芽孢染色及酵母菌的观察组别*
