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1、*传统发酵工程：利用微生物的生长和代谢活动来大量生产人们所需产品的过程理论与工程技术体系。该 技术体系主要包括菌种选育与保藏、菌种扩大生产、代谢产物的生物合成与分离纯化制备等技术集成。*现代发酵工程：是将DNA重组及细胞融合技术、酶工程技术、组学及代谢网络调控技术、过程工程优 化与放大技术等新技术与传统发酵工程融合，大大提高传统发酵技术水平，拓展传统发酵应用领域和产 品范围的一种现代工业生物技术体系（新一代工业生物技术）。*通气搅拌解决了液体深层培养的供氧问题。 *无菌空气、培养基灭菌、无污染接种、大型发酵罐的密封与抗污染设计解决了耗氧 发酵中的杂菌污染问题。*通气搅拌发酵技术的建立意义： 推
2、动抗生素工业乃至整个发酵工业快速发展 建立了完整的好氧发酵放大技术及装备 奠定了现代发酵工业的理论和实践基础*代谢控制发酵技术：应用生物化学的代谢知识和遗传学理论，选育微生物突变株，从而调控微生物代谢， 大量积累目标发酵产物。* 发酵工业的特点- 发酵过程二般是在常温常压下进行的生化反应，反应安全，要求条件较简单。- 可用较廉价原料生产较高价值产品。- 反应专一性强。- 能够专一性地和高度选择性地对某些较为复杂的化合物进行特定部位的生物转化修饰。- 发酵过程中对杂菌污染的防治至关重要。 菌种是关键。- 发酵生产不受地理、气候、季节等自然条件限制。工业对菌种的要求*1、培养基原料来源广、廉价，且
3、生成的目的产物的产量高；2、生长较快，发酵周期短；3、培养条件易控制；4、抗噬菌体及杂菌能力强；5、菌株不易变异退化；6、对设备放大的适应性强；7、菌体本身不能是病原菌；工业发酵生产菌种来源 * 1、从自然界分离筛选 2、从菌种保藏机构获得 3、从生产过程中已有的菌种中筛选发生正突变的优良菌种 以从自然界筛选菌种为例，筛选步骤： *1 、样品的采集2、目的菌的富集培养4、菌种的初筛5、菌种的复筛6、菌种发酵性能的鉴定7、菌种的保藏 *初筛菌种的目的是除去大部份（8090 %）明确不符合要求的菌株，尽量保留优良菌株；以量为主，精确为次；尽 可能简单、快速和经济。* 初筛：以迅速筛出大量的达到初步
4、要求的分离菌落为目的，以量为主。* 复筛：则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。*用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称为诱变育种。* 诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂 常用诱发剂及其特点*物理诱变剂紫外线、X-射线、Y-射线、快中子特点：紫外线方便、有效、使用安全，其他的几种射线有一定的穿透力化学诱变剂 碱基类似物、吖啶类、烷化剂 特点：高效、经济、但应注意使用安全出发菌株的选择*1. 选择纯种2. 平均发酵单位要高，且发酵单位的波动幅度不同，摇瓶间所测得结果的最高值和最低值之差要小。3. 有良好的代谢特性4. 选择对诱变剂敏感的菌株。5. 选用多个出发菌株进行
5、诱变收效较较快。诱变剂的选择 *野生型菌株（遗传性不稳定）:用缓和的诱变剂。遗传性稳定的菌株:先要用强烈的不常用的诱变谱广的诱变剂处理，使其发生强烈的变异，然后再用缓 和的诱变剂进行处理或多次自然分离。要考虑诱变剂的作用机理来选择诱变剂，两种诱变剂复合使用效果好。最适剂量（有 2 种观点）：杀菌率90%99%较好，甚至 99.9%;杀菌率75%85菌种保藏原理 *通过保持 缺营养，缺氧，干燥和低温， 使菌种处于“休眠状态”，抑制其繁殖能力。 常用的菌种保藏方法*1、斜面低温保藏法2、石蜡油封保藏法3、冷冻干燥法4、液氮超低温冻结法等5、砂土保藏法斜面低温保藏法（定期移植法）*将菌种接种在适宜的
6、斜面培养基上，待菌种生长完全后，置于4C左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（1 3 月）再转接至新的斜面培养基上。适用于细菌、放线菌、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜用冷冻干燥保藏的菌种。 优点：简便易行，容易推广，存活率高，故科研和生产上对经常使用的菌种大多采用这种保藏方法。 缺点：菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污 染。矿油封藏法（液体石蜡保藏法）* 在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面上，高出斜面顶端 lcm使培养物与空气隔绝，加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或4C冰箱内保藏。保存期为1年。 优点
7、：1、保存时间长，能使保藏期达12年。2、操作简单，适于保藏霉菌、酵母菌、放线菌、好氧性细菌等，对霉菌和酵母菌的保藏效果较好。 缺点：1、对很多厌氧性细菌的保藏效果较差，2、不适用于某些能分解烃类的菌种。冷冻（真空）干燥保藏法 *简称：冻干法。用保护剂制备拟保藏菌种的细胞悬液或抱子悬液于安瓿管中，再在低温下快速将 含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华将样品脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块。并在真空条 件下立即融封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，使微生物处于休眠状态，而得以长期保藏常用的保护剂有脱脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等高分子物质。 冷冻（真空）干燥保藏法优缺点*1、同时具备低温、干燥、缺
8、氧的菌种保藏条件，保藏期长，一般达515年，2、存活率高，变异率低，较理想。3、除不产孢子的丝状真菌不宜用此法外，其他大多数微生物均适用。4、操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻干机等设备。液氮超低温保藏法的优缺点 * 1、操作简便、高效、保藏期一般可达到15年以上，是目前被公认的最有效的菌种长期保藏技术 之一。 2、除了少数对低温损伤敏感的微生物外，该法适用于各种微生物菌种的保藏。 3、可使用各种培养形式的微生物进行保藏，无论是孢子或菌体、液体培养物或固体培养物均可采 用该保藏法。 缺点：需购置超低温液氮设备，且液氮消耗较多，操作费用较高。 菌种保藏注意事项 *1. 选择适当的保藏方法2.
9、选取新鲜的生长丰满的菌种来保藏。3. 严格控制传代次数，培养基碳源要少些，营养贫乏些。沙土管注意干燥，真空冷冻干燥的真空度要高。4. 保藏一定时间后要重新复壮，再保藏。5. 保藏过程要防止染菌。6 保藏菌种恢复培养基时，要移接到保藏以前所用的同一培养基上进行培养，以维持优良性能的稳定。 种子罐级数的确定 *一级种子培养一二级发酵二级种子培养一三级发酵三级种子培养 一 四级发酵 种子罐的级数主要决定于菌种的性质和菌体生长速度及发酵设备的合理应用。种子罐级数越少，越有利于简化工艺，便于控制，减少染菌；种子罐级数取决于：* 种子的性质（生长繁殖性能）；抱子瓶中抱子的密度；抱子发芽及菌丝繁殖速度；发酵
10、罐中种子的 最低接种量； 种子罐与发酵罐的容积比。影响种子质量的主要因素 * 1、培养基： 主要是碳源、氮源、无机盐、生长素和水等。 选用原则：组分简单，来源丰富，价格便宜，取材方便等。种子培养基是培养菌体的（以菌体 增殖为主要目的），应该是糖份少而氮源多些。2. 培养温度和湿度最适温度，特别是抱子培养过程中。龟裂链霉菌斜面培养温度为36.5-37微生物的最佳生长温度与生产温度是相对的可通过驯化改变 对于孢子的培养，尤其是固体培养，斜面培养与相对湿度有关3. 培养时间孢子培养时间对土霉素菌种的影响斜面培养 4.5 天，孢子尚未成熟冷藏78 天菌丝开始自溶斜面培养 5 天，孢子完全成熟冷藏20
11、天也没有自溶现象4、种龄种龄：过老过嫩都不好； 细菌以对数生长期为宜（霉菌）； 酵母以二倍体细胞为好； 最适种龄根据本批种子质量来确定。细菌种龄 7-24 小时；霉菌种龄16-50小时。放线菌种龄21-64小时5、接种量 接种量移入发酵罐的种子液和移种后发酵液的体积比例。接种量=f （菌种特性；种子质量；发酵条件等）抗生素发酵7%15%氨基酸、有机酸、溶剂发酵1%5%。6、pH 值：7、染菌的控制8、通气搅拌9、泡沫 发酵罐的接种量的大小与菌种特性、种子质量和发酵条件等有关。不同微生物其发酵的接种量是不同 的。 *接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中的繁殖速度。 * 培养基：广义上讲培养基是指
12、一切可供微生物细胞生长 繁殖所需的一组营养物质和原料。 同时培养基也为微生物培养提供除营养外的其它所必须的条件。一、设计工业发酵的培养基应遵循原则*1、必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分；2、有利于减少培养基原料的单耗，即提高单位营养物质的转换率。3、有利于提高产物的浓度，以提高单位容积发酵罐的生产能力。4、有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期。5、尽量减少副产物的形成，便于产物分离纯化。6、原料价格低廉，质量稳定，取材容易。7、所用的原料尽可能减少对发酵过程中的通气搅拌的影响，利于提高氧的利用率。降低能耗。8、有利于产品的分离纯化，并尽可能减少“三废”物质。葡萄糖过多，会引起葡萄糖
13、效应* 即会过分地加速菌体的呼吸，使培养基中的溶解氧供不应求，使一些中间代谢产物（如丙酮酸、乳酸、乙 酸等）不能完全氧化而积累在菌体内或培养基中，导致 pH 下降，影响某些酶的活性，从而抑制微生物的 生长和产物的合成。*正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的pH有积极作用。* 所以选择合适的无机氮源有两层意义：（1） 满足菌体生长; （2） 稳定和调节发酵过程中的 pH。* 使用氨水时要注意：（1）要少量多次流加，加强搅拌，防止局部过碱。（2）使用前用石棉等介质过滤，除去多种嗜碱性微生物，防止染菌。 *玉米浆是玉米淀粉生产中的副产物，其中固体物含量在 50。可溶性蛋白、生长因子（生物素
14、）、苯乙 酸还含有有机酸、还原糖、磷、微量元素、生长素。使用什么样的玉米浆才能使发酵的进程更优化、发酵结果更稳定？* 因为液体玉米浆不均一、稳定性差、极容易沉淀，夏天更易染菌变质而导致其有效成分的丧失或 不足，从而影响发酵的稳定性。所以，现今微生物技术领先的大型发酵企业（尤其是某些技术先 进的抗菌素和酶制剂厂家）都纷纷改用玉米浆的最新换代产品“高氮”型玉米浆干粉，因其有 着极大的优点，且蛋白质含量可高达 50%.1. 有机氮源和无机氮源应当混合使用* 早期：容易利用易同化的氮源无机氮源。中期：菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白质C： N = f （菌种、发酵阶段、碳源种类、氮源种类、通气强度、搅
15、拌强度等等），无完全统一的标准。* 一般来说，细菌和酵母细胞的碳氮比为 5:1，霉菌细胞的碳氮比为 10:1，所以霉菌 培养基的碳氮比大 而细菌的碳氮比小。* 培养基的碳氮比不仅会影响微生物菌体的生长，同时也会影响到发酵的代谢途径。不同的微生物菌种、 不同的发酵产物所要求的碳氮比是不同的，即使是同一微生物在不同的培养阶段，对培养基的碳氮比的要 求也是不一样的。三、无机盐的微量元素作用 * 构成菌体成分； 作为酶活性基的组成部分或维持酶的活性； 调节渗透压、 pH 值、氧化还原电位等； 作为自养菌的能源4、无机盐的微量元素使用注意点*A. 有的来源可能带有过多的某种无机离子和微量元素在发酵过程中必须加以考虑。B. 要避免钙盐
