植物细胞培养生产次生代谢产物的影响

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1、植物细胞培养生产次生代谢产物的影响 植物细胞培养条件温度：培养温度对植物细胞生长及二次代谢产物生成有重要影响。通常，植物细 胞培养采用25C。搅拌：在摇瓶实验中，通常摇床的转速取90 120r/min。pH值：通过细胞膜进行的H+离子传递对细胞的生育环境、生理活性来说无疑是 重要的。在培养过程中，通常pH作为一个重要参数被控制在一定范围内。植物 细胞培养的适宜pH值一般为5 6。通气：通气是细胞液体深层培养重要的物理化学因子。好气培养系统的通气与混 合及搅拌是相互关联的。对摇瓶试验，通常500ml的三角瓶内装80 200m 1的 植物细胞培养液较适宜。当然，气液传质还与瓶塞的材料有关。试验表明

2、，从溶 氧速率考虑，以棉花塞最好，微孔硅橡胶塞次之，铝箔塞最差。光：光对植物有着特殊的作用。光照射条件不仅通过光照周期、光的质量（即种 类、波长）而且通过光照量（光强度）的调节来影响植物细胞的生理特性和培 养特 性。研究表明，光调节着细胞中的关键酶的活性，有时光能大大促进代谢产物的 生成，有时却起着阻害作用。细胞龄：在培养过程的不同时期，细胞的生理状况、生长与物质生产能力差异显 著。而且，使用不同细胞龄的种细胞，其后代的生长与物质生产状况也会大不 一 样。通常，使用处于对数生长期后期或稳定期前期的细胞作为接种细胞较合适。接种量：在植物细胞培养中，接种量也是一个影响因素。在再次培养中，往往取 前

3、次培养液的 520作为种液，也以接种细胞湿重为基准，其接种浓度为 15 50g（湿细胞）/L。由于接种量对细胞产率及二次代谢物质的生产有一定影 响，故应根据不同的培养对象通过试验，确定其最大接种量。影响植物细胞培养的因素植物细胞生长和产物合成动力学也可分为三种类型：生长偶联型，产物的合成与细胞的生 长呈正比；中间型，产物仅在细胞生长一段时间后才能合成，但细胞生长停止时，产物合 成也停止；非生长偶联型，产物只有在细胞生长停止时才能合成。事实上，由于细胞培养 过程较复杂，细胞生长和次级代谢物的合成很少符合以上模式，特别是在较大的细胞群体中， 由于各细胞所处的生理阶段不同，细胞生长和产物合成也许是群

4、体中部分细胞代谢的结果。 此外，不同的环境条件对产物合成的动力学也有很大的影响。1、细胞的遗传特性 从理论上讲，所有的植物细胞都可看做是一个有机体，具有构成一个完整植物的全部遗传信 息。在生化特征上，单个细胞也具有产生其亲本所能产生的次生代谢物的遗传基础和生理功 能。但是，这一概念决不能与个别植株的组织部位相混淆，因为某些组织部位所具有的高含 量的次生代谢物并不一定就是该部位合成的，而有可能是在其他部位合成后通过运输在该部 位上积累的。有的植物在某一部位合成了某一产物的直接前体而转运到另一部位，通过该部 位上的酶或其他因子转化。如尼古丁是在烟草根部细胞内合成后输送到叶部细胞内的，另外 有些次生

5、物在植物某一部位形成中间体，然后再转移另一部位经酶转化而成。因此，在进行 植物细胞的培养时，必须弄清楚产物的合成部位。同时，在注意到整体植物的遗传性时，还 必须考虑到各种不同的细胞。细胞种质影响2、培养环境由于各类代谢产物是在代谢过程的不同阶段产生的，因此通过植物细胞培养进行次生代谢产 物生产所受的限制因子是比较复杂的。各种影响代谢过程的因素都可能对它们发生影响，这 些因素主要有光、温度、搅拌、通气、营养、pH值、前体和调节因子等。(1) 温度植物细胞培养通常是在25C左右进行的，因此一般来说在进行植物细胞培养时很少 考虑温度对培养影响。但是实际上，无论是细胞培养物的生长或是次生代谢物的合成和

6、积累， 温度都是起着一定的作用，需要引起一定的重视。(2) pH值植物细胞培养的最适pH值一般在56。但由于在培养过程中，培养基的pH值可能 有很大的变化，对培养物的生长和次生代谢产物的积累十分不利，因此需要不断调节培养液 的 pH 值，以满足细胞的生长和产物代谢、积累的需要。(3) 营养成分尽管植物细胞能在简单的合成培养基生长，但营养成分对植物细胞培养和次生 代谢产物的生成仍有很大的影响。营养成分一方面要满足植物细胞的生生长所需，另一方面 要使每个细胞都能合成和积累次生代谢产物。普通的培养基主要是为了促进细胞生长而设计 的，它对次生代谢产物的产生并不一定最合适。一般地说增加氮、磷和钾的含量会

7、使细胞的 生长加快，增加培养基中的蔗糖含量可以增加细胞培养物的次生代谢物。(4) 光光照时间的长短、光的强度对次生代谢产物的合成都具有一定的作用。一般来说愈伤 组织和细胞生长不需要光照，但是光对细胞代谢产物的合成有很重要的影响。有人研究了光 对黄酮化合物形成的影响，结果表明，培养物在光照特别是紫外光下黄酮及黄酮类醇糖苷积 累的所有酶活性均增加。通常光照采用荧光灯，或者荧光灯和白炽灯混合，其光强度是300 100001x(6100“m/m2穝)可以连续光照，也可以每天光照1218h。(5) 搅拌和通气植物细胞在培养过程中需要通入无菌空气，适当控制搅拌程度和通气量。在 悬浮培养中更要如此。在烟草细

8、胞培养中发现，如果K aW5h-1。，对生物产量有明显抑制作L用。当巒5叽，初始的a和生物产量之间有线性关系。当然不同的细胞系，对氧的 需求量是不相同的。为了加强气-液-固之间的传质，细胞悬浮培养时，需要搅动。植物细胞 虽然有较硬的细胞壁，但是细胞壁很脆，对搅拌的剪切力很敏感，在摇瓶培养时，摇瓶机振 荡范围在100150r/min。由于摇瓶培养细胞受到剪切比较小，因此植物细胞很适合在此环 境生长。实验室中采用六平叶涡轮搅拌桨反应器培养植物细胞，由于剪切太剧烈，细胞会自 溶，次生代谢产物合成会降低。各种植物细胞耐剪切的能力不尽相同，细胞越老遭受的破坏 也越大。烟草的细胞和长春花的细胞在涡轮搅拌器

9、转速150r/min和300r/min时，一般还 能保持生长。培养鸡眼藤的细胞时，涡轮搅拌器的转速应低于20r/min。因此培养植物细 胞，气升式反应器更为合适。(6) 前体在植物细胞的培养过程中，有时培养细胞不能很理想地把所需的代谢产物按所想像 的得率进行合成，其中一个可能的原因就是缺少合成这种代谢物所必须的前体，此时如在培 养物中加入外源前体将会使目的产物产量增加。因此，在植物细胞培养过程中，选择适当的 前体是相当重要的。对于所选择的前体除了有增加产物产量的外，还要求是无毒和廉价。但 是，寻找能使目的产物含量增加最有效的前体是有一定难度的。虽然前体的作用在植物细胞培养中未完全清楚，可能是外

10、源前体激发了细胞中特定酶的作 用，促使次生代谢产物量的增加。有人在三角叶薯蓣细胞培养液中加人 100mg/L 胆甾醇，可 使次生代谢产物薯蓣皂甙配基产量增加一倍。在紫草细胞培养中加入L-苯丙氨酸使右旋紫 草素产量增加三倍。在雷公藤细胞培养中加入萜烯类化合物中的一个中间体，可使雷公藤羟 内酯产量增加三倍以上。但同样一种前体，在细胞的不同生长时期加入，对细胞生长和次生 代谢产物合成的作用极不相同，有时甚至还起抑制作用。如在洋紫苏细胞的培养中，一开始 就加入色胺，无论对细胞生长和生物碱的合成都起抑制作用，但在培养的第二星期或第三星 期加入色胺却能刺激细胞的生长和生物碱的合成。(7) 生长调节剂在细胞

11、生长过程中生长调节剂的种类和数量对次生代谢产物的合成起着十分 重要的作用。植物生长调节剂不仅会影响到细胞的生长和分化，而且也会影响到次生代谢产 物的合成。生长素和细胞分裂素有使细胞分裂保持一致的作用，不同类型的生长素对次生代 谢产物的合成有着不同的影响。生长调节剂对次级代谢的影响随着代谢产物的种类的不同而 有很大的变化，对生长调节剂的应用需要非常慎重。目前，在大规模植物细胞悬浮培养中，为了提高生物量和次生代谢产物量，一般采用二阶段 法。第一阶段尽可能快地使细胞量增长，可通过生长培养基来完成。第二阶段是诱发和保持 次生代谢旺盛，可通过生产培养基来调节。因此在细胞培养整个过程中，要更换含有不同品

12、种和浓度的植物生长激素和前体的液体培养基。为了获得能适合大规模悬浮培养和生长快速 的细胞系，首先要对细胞进行驯化和筛选，把愈伤组织转移到摇瓶中进行液体培养，待细胞 增殖后，再把它们转移到琼脂培养基上。经过反复多次驯化筛选得到的细胞株，比未经过驯 化、筛选的原始愈伤组织在悬浮培养中生长快得多。毋庸置疑，在过去几十年中，植物生物技术方面已取得了相当巨大的进展，大大缩短了向工 业化迈进的距离。国内有关单位对药用植物，人参、三七、紫草、黄连、薯蓣、芦笋等已展 开了大规模的细胞悬浮培养，并对植物细胞培养专用反应器进行研制。国外，培养植物细胞 用的反应器已从实验规模130L,放大到工业性试验规模13020

13、000L,如希腊毛地黄转化 细胞的培养规模为2ms,烟草细胞培养的规模最大已达到20mso 值得注意的是影响植物细胞培养物的生物量增长和次生代谢产物积累的因素是错综复杂的， 往往一个因素的调整会影响到其他因素的变化，所以，需要在培养过程中不断加以调整，同 时，由于不同的植物有机体有自身的特殊性。因此，对于一种植物或一种次生代谢物适合的 培养条件，不一定对其他的细胞或次生代谢作用适合。植物细胞培养是指在离体条件下培养植物细胞的方法。将愈伤组织或其他易分散的组织置于 液体培养基中，进行振荡培养，使组织分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖， 获得大量的细胞群体。小规模的悬浮培养在培养瓶中进行

14、，大规模者可利用发酵罐生产。. 利用植物细胞培养生产代谢产物具有十分广阔的前景。 . 植物细胞培养 条件 优化目前植物细胞培养生产的化合物很多，包括糖类、酚类、脂类、蛋白质、核酸 以及帖类和生物碱等初生和次生代谢产物，植物细胞培养的应用主要包括以下3 个方面：有用物质（次生代谢产物）的生产；植物无性系的快速繁殖和遗传突变 体的筛选；植物细胞遗传、生理、生化和病毒方面的深入研究。但是由于植物细 胞大规模培养技术的局限性使得植物细胞仍难以实现大规模工业化生产，迫切需 要进一步研究和发展细胞培养条件的优化控制及其工艺。 1 植物细胞悬浮培 养条件的优化1.1 植物细胞培养过程中物理因素的优化控制对于

15、植物细胞培养来说，环境 中的许多物理因素对细胞的生长以及目标次生代谢产物的合成具有很大的影响。 如通过温度、光照、电场、磁场电磁辐射、机械力以及超声波等对于植物细胞培 养过程都有着十分重要的作用。植物细胞的生长、繁殖和次生代谢物的生产需要 一定的温度条件，在一定的温度范围内细胞才能正常生长、繁殖和维持正常的新 陈代谢，植物细胞培养的最适温度一般为25C，但不同的植物种类略有差异， 而且植物细胞生长和次生代谢产物的合成所需的温度并不一致，因此选择合理的 培养温度并进行相应的调控对于细胞生长以及产物合成十分关键1.2 植物细胞培养过程中化学因素的优化控制植物细胞培养过程中的 一些化学因素如培养基组

16、成、溶氧、其它添加物等对于细胞的生长也具有十分重 要的意义。合理的培养基组分、适当的溶氧以及其它诱导子及其前体等物质的有 效调控能够在很大程度上促进细胞的生长以及次生代谢物的合成。培养基中的碳 源、氮源及其一些微量的金属离子以及一些有机物质不仅是细胞生长以及合成的 物质基础，而且很多都能够促进细胞生长或者是有利于产物的形成。植物细胞培 养通常使用蔗糖作为碳源，研究表明，一定浓度的蔗糖不仅能够促进植物细胞的 生长，还能够刺激次生物质的合成，2 植物细胞培养相关模型的研究进展利用植物细胞培养生产药物，已发展成植物细胞培养在生产运用中的主流之 一。目前全世界约有四分之三的人以植物作为预防疾病的药物来源。因葡萄球菌、 大肠杆菌、结核杆菌等都表现出对由微生物来源的各种抗生素的耐药性，人们对 抗生素类药的局限性已有了深刻的认识。植物产生的药物在微生物中很少发现， 而且植物产生的药能克服微生物来源药物的诸多不足，而化学合