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1、光度分析法B -氨基丙酸和茚三酮溶液在弱酸的条件下可以生成蓝紫色物质7,其颜色深浅主要与B-氨基 丙酸的浓度有关。因此可利用此显色反应采用比色法定量测量B-氨基丙酸。我在实验中发现很多 因素如浓度、pH值、反应温度、以及反应时间等对此显色反应有很大的影响。如忽视这些因素会 使实验产生很大的误差。就此显色反应的最佳条件我做了初步的探究。试剂的配制：缓冲液的配制：配制pH=的NaAc-HAc缓冲溶液B -氨基丙酸标准溶液的配制：用电子天平准确称取gB-氨基丙酸（生化纯），溶于250ml pH=缓冲溶液中，得到C = g/L标 准溶液。茚三酮试剂的配制：称取茚三酮溶于100ml蒸馏水中，得到 5g/
2、L的茚三酮水溶液。 标准曲线的确定分别准确移取标准液于8个比色管中，用pH=的缓冲溶液稀释到再加入1ml茚三酮水溶液充分摇匀，将其放在沸水浴中加热10min。冷却到室温，用7230型分光光度计在569nm下测 其吸光度。以吸光度和浓度作一个标准曲线。样品的测定稀释待测液于mlml,调pH值到，以相同的反应条件，测其吸光值并与上面的标准曲线对照 查出稀释液的浓度，再乘以稀释倍数即为B-氨基丙酸的浓度。标准曲线的测定结果B-氨基丙酸浓度在mlml范围内与茚三酮水溶液反应，颜色表现出由浅蓝到深蓝的递增变化。 用茚三酮比色法测得的一组数据得到的标准曲线如图1：图 1标准曲线的测定Fig 1 Deter
3、mination of the standard curve注：在沸水中加热10min，B-氨基丙酸标准溶液5ml、茚三酮水溶液1ml、缓冲溶液pH= 样品的测定分析将待测的一批稀释50倍，母液稀释的程度可以根据以与标准溶液在相同的反应条件下反应， 再观察样品的显色程度而确定。取稀释后的产物液1ml,用戸圧的缓冲液稀释到5ml再加入1ml茚 三酮水溶液，在沸水中加热10min,测得如下数据如表3：表3 样品的测定Table 3 Determination of sample待测液序号待测液所对应的反应时间吸光度A110h220h322h浓度对显色反应的影响:实验表明，B-氨基丙酸与茚三酮水溶液
4、在表3所注的条件反应的最低浓度为ml,随着B-氨基丙 酸的浓度变大显色逐渐变深。当浓度大于ml时，所显颜色过深或生成紫色化合物影响其吸光度。 当B-氨基丙酸的浓度在mml时，颜色变化明显而且稳定，因此，我选定此浓度范围作为测定范 围。得到的数据如表4：表4 浓度对显色反应的影响Table 4 Concentration on the color reaction标准液的浓度(mg/ml)颜色变化基本无色浅蓝吸光度A蓝深蓝蓝紫注：在沸水中加热10min，标准溶液的体积为5ml,加入1ml茚三酮水溶液。pH值对显色反应的影响以ml的标准溶液5ml，加入1ml茚三酮水溶液在沸水中加热10min,观察
5、到的颜色变化如表5：表5 pH值对显色反应的影响Table 5 The influence of pH on the color reactionpH值颜色无色浅蓝浅蓝蓝蓝深蓝红棕 色红棕色红棕色注：在沸水中加热10min，B-氨基丙酸标准溶液5ml、茚三酮水溶液1ml、缓冲溶液Ph= 显色反应随着pH值得不同，颜色有着明显的变化。当pH值小于时几乎无色，而在 pH值在一 时颜色变化明显。pH值为，加热不到二分钟即显色；pH值为，加入茚三酮溶液后不加热30s左右 即显红棕色；茚三酮水溶液在强碱的条件下带有明显的淡黄色。因此pH值为左右最好。故我选定 pH值为。此时显色明显无干扰且稳定。温度和反
6、应时间的影响： 实验表明：温度和反应时间对此显色反应的影响很大。温度太低，反应太慢导致显色时间长， 而且显色效果不好。而温度过高，反应时间长对此反应影响也很大，会生成紫色化合物影响其吸 光度。在显色反应中，反应时间主要根据具体的颜色变化而定。一般来说，B-氨基丙酸浓度在ml ml时，在沸水中加热10min即可，时间太短，反映不完全颜色梯度不明显。时间过长，溶液挥 发严重也影响其吸光度。故我把反应时间定在10min左右。其他因素的影响 不同溶剂的茚三酮溶液对显色反应也有一些影响。为了区别它们对显色反应的影响，我做了 如下实验：分别称取茚三酮三份，分别溶于乙醇、水、丙酮各100ml中，可以观察到：
7、丙酮溶解 茚三酮的速度最快，乙醇次之。移取B-氨基丙酸标准溶液l)1ml三份，用pH值为的NaAcHAc缓 冲溶液稀释到5ml再依次加入1ml茚三酮水溶液、乙醇溶液以及丙酮溶液，在沸水中加热。实验 表明：在加热加in时，乙醇溶液开始显色；丙酮溶液的显红棕色；水溶液无色。在加热6min时， 丙酮溶液的颜色加深；水溶液显浅蓝色；乙醇溶液的所显颜色最深。乙醇易挥发，在加热的条件下挥发更严重。基于这一点的考虑，我采用茚三酮水溶液。而茚三 酮的用量对此显色反应的影响不大，可以选择5ml的被测液与1ml(5g/1)的茚三酮水溶液反应。测 定时，最好选择标样与待测液在同一水浴。这样可以减少误差提高测定的准确
8、度。另外，当被测液中含有其他的氨基酸或是含氨基的化合物也可以与茚三酮发生显色反应，影响 测定结果。总之，茚三酮比色法作为一种B-氨基丙酸的定量检测方法具有操作简单、成本低的优 点。只要控制好反应条件就能得到较好的测量结果。三茚三酮比色法：1原理：氨基酸在一定pH范围内，能与茚三酮生成兰紫色化合物。可以用比色法定量测定。2试剂：（1）磷酸缓冲液（）制备方法如下：称磷酸二氢钾。定容500ml称NAHPO12H 0?分别溶解定容500ml242取磷酸二氢钾10ml与磷酸氢二钠190ml混合即为的缓冲液（2）2%茚三酮溶液：称茚三酮1gf溶于35ml热水加入40mg氯化亚锡（SnClH0）搅拌过滤（作
9、防腐剂）于冷2 2暗处过夜f定容50ml?氨基酸标液称干燥氨基酸（如异亮氨酸）f溶解定容100mlf摇匀f吸10ml于另外100ml容量瓶定容100ml, 即得200Ug/ml标液3操作方法：（1）绘制标准曲线：取7个25ml容量瓶，吸取标液?0? ? ? ? ? ?于7个25ml容量瓶，加水补充至容积为4ml,然后加茚三酮和缓冲液各1ml,于水浴加热15分钟，冷却后定容25ml,静置15 分钟，在570nm下测消光值，绘制标准曲线。（2）样品测定：取样品 （液体样5T0ml）f于烧杯中f加50ml水和活性碳约5gf加热过滤f用3040ml热水洗涤活性炭f吸澄清样液14mlf加茚三酮和缓冲液各
10、1ml水浴加热15分钟， 冷却定容，静置15分钟于570nm下测定消光值，按下式计算氨基酸含量。氨基酸含量（毫克/100 克）=C/ （WX1000）X100C从标准曲线上査得得氨基酸的量（Ug）W测定得样品溶液相当于样品的量（g）注意事项：茚三酮受阳光、温度、湿度、空气等影响易被氧化呈淡红或深红色，使用前要进行纯化，方法如 下：取10g茚三酮容于40ml热水中，加一克活性炭，摇匀静置30分钟，过滤，将滤液放入冰箱中过 滤，即出现兰色结晶，过滤，用加l冷水洗涤结晶，置干燥皿中干燥，装瓶备用。茚二酮显色法测定氨基酸含量一、目的学习茚三酮显色法测定氨基酸含量的方法二、原理茚三酮溶液与氨基酸共热，生
11、成氨。氨与茚三酮和还原性茚三酮反应，生成紫色化合物。该 化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比，可通过测定570nm处的光密度，测定氨基酸的含量。三、试剂与材料(1) 标准氨基酸溶液：配制成L溶液。(2) ，2mol/L醋酸缓冲液：量取86mL 2mol/L醋酸钠溶液，加入14mL 2mol/L乙酸混合而成。 用pH检查校正。(3) 茚三酮显色液：称取85mg茚三酮和15mg还原茚三酮，用10mL乙二醇甲醚溶解。茚三酮若变为微红色，则需按下法重结晶：称取5g茚三酮溶于1525mL热蒸馏水中，加入活 性炭，轻轻搅拌。加热30min 后趁热过滤，滤液放入冰箱过夜。次日析出黄白色结晶，抽滤，用1 mL
12、冷水洗涤结晶，置干燥器干燥后，装入棕色玻璃瓶保存。还原型茚三酮按下法制备：称取5g茚三酮，用125mL沸蒸馏水溶解，得黄色溶液。将5g维生 素C用250mL温蒸馏水溶解，一边搅拌一边将维生素C溶液滴加到茚三酮溶液中，不断出现沉淀。 滴定后继续搅拌15min，然后在冰箱内冷却到4C,过滤、沉淀用冷水洗涤3次，置五氧化二磷真 空干燥器中干燥保存，备用。乙二醇甲醚若放置太久，需用下法除去过氧化物：在500mL乙二醇甲醚中加入5g硫酸亚铁， 振荡12h，过滤除去硫酸亚铁，再经蒸馏，收集沸点为121125C的馏分，为无色透明的乙二 醇甲醚。(4) 60乙醇。(5) 样品液：每毫升含50ug氨基酸。(6)
13、 分光光度计。(7) 水浴锅。四、操作步骤1标准曲线的制作分别取L的标准氨基酸溶液0,，于试管中，用水补足至1mL。各加入1mL , 2mol/L 醋酸缓冲液；再加入1mL茚三酮显色液，充分混匀后，盖住试管口，在100 C水浴中加热15min, 用自来水冷却。放置5min后，加入3mL 60%乙醇稀释，充分摇匀，用分光光度计测定0D 。（脯 570nm氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，应测定0D ）。440nm以0D 为纵坐标，氨基酸含量为横坐标，绘制标准曲线。570nm2氨基酸样品的测定取样品液1mL,加入，2mol/L醋酸缓冲液1mL和茚三酮显色液1mL，混匀后于100C沸水浴中 加热15min,自来水冷却。放置5min后，加3mL 60%乙醇稀释，摇匀后测定0D（生成的颜色570nm在60min内稳定）。将样品测定的0D 与标准曲线对照，可确定样品中氨基酸含量。570nm五、?结?果计算0D 对应标准曲线查得570nm氨基酸含量（mmol/L） =值1 000
