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1、高效液相色谱法（Waters2695-29982424 HPLC）测定乳酸凝结芽抱杆菌一样品准备：1、用250ml三角瓶装50ml的培养基，接种BCD菌株，接种量为3%,摇床发酵 200r/min,温度37C，发酵时间18h,离心5000r/min,10min，取上清液。2、去除上清液中的碳酸钙：取4 ml发酵液于5 ml离心管中，经8000 r/min离 心10 min以除去碳酸钙和菌体，取离心后的上清液2 ml，再加入2 ml 0.5 mol/L 的硫酸水溶液进行酸解，离心除去硫酸钙，取1 ml上清液经适当稀释后，再以 0.45 “m的滤膜过滤即得待测液。二标准品准备：1、乳酸、乙酸、丙酸
2、和丁酸2、草酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、NH4H2PO4、磷酸3、甲酸，苹果酸，乳酸，乙酸，柠檬酸，琥珀酸和丙酸4、甲酸，苹果酸，乳酸，乙酸，柠檬酸，琥珀酸和丙酸（色谱纯）5、草酸、酒石酸、苹果酸、抗坏血酸、乳酸、冰乙酸、柠檬酸、丁二酸 （均为分析纯）。三仪器准备：准备流动相，和水，乙腈，甲醇1、首先打开计算机，运行Empower软件，选择存放数据文件的Project，运行Run Samples ;按软件中的Develop Methods按钮，建立仪器方法，并保存至方法组， 按Monitor按钮，观察基线平衡，可准备进样。2、开机（仪器）2.1打开Allianee 2695
3、和2489的电源开关至0N（1）的位置，仪器开始进行自检。2.2仪器将进行大约5min的自检过程，待仪器自我测试完毕后，出现一下画面, 画面上方的状态显示会出现“ idle ”状态，表示开机测试正常。2.3灌注柱塞密封清洗泵2.3.1回到Menu画面，选择Diag2.3.2确定Seal Wash的管路放在正确的位置2.3.3按Prime Seal Wash，再按START，直到清洗溶剂流出泵杆密封圈冲洗废液管，（大概听哒哒的声音30s），按Halt，在重复一次上述操作2.3.4 按 CLOSE3、灌注针头清洗泵3.1按Menu/Status键，进入STAUS画面,利用方向键将光标移至Compo
4、sition” 字段，将欲WET PRIME的溶剂输入100%。3.2 按 DIRECT FUNCTION 功能键， 选择 wet prime，按 enterWet prime 的设定值，一般为 flow rate： 7.5ml/min ,Time:3.0 min,然后按下OK键，泵即开始进行WET PRIME操作3.3重复上述的步骤直到对所有溶剂的WET PRIME执行完毕。 注意先乙腈后水4、冲洗进样器4.1按Menu/Staus键，进入Staus画面，在设定溶剂的画面中设定适当的流 速与溶剂比例(针对缓冲盐或离子对试验，建议设定50%乙腈；50%水的溶剂来 冲洗进样器)4.2 按 Dir
5、ect Function 键，选择 Purge Injector，按 Eenter4.3输入Sample loop体积清洗的倍数(原定值为6倍)，按Enter4.4压缩测试(Compression Check )请先不需要测试，设定完后按0K5、装载样品盘数代号颜色编号A蓝色1-24B黄色25-48C红色49-72D绿色73-96E白色97-120四样品条件设置方法一：文献：产L_乳酸菌种的选育和发酵条件的研究_高江婧乳酸总量测定有机酸：乳酸采用高压液相色谱法测定,色谱柱为美国Merck公司的ZORBAX SB-Aq,150 X 4.6(5 ”m)， 流速0.5 ml/min，紫外检测波长21
6、0 nm,进样量10 “I,流动相为 水(含 0.02 moI/LKH2PO4)：乙腈=995:05,柱温为 30C。乳酸标样在ZORBAX SB-Aq柱上经高效液相色谱(HPLC)进行分析，自动进样，乳酸 的保留时间为4.8 min。其色谱图如图2.1所示。图1 2菌株ES-2 3液相色诸图Fig3.2 The liquid cluom atography chart of strain ES-23方法二：（蜡样芽抱杆菌）文献：一株具有产酸能力的芽抱杆菌的筛选及性能检测 菌株代谢产物（有机酸）分析：采用发酵培养基，2 5 0 mL三角瓶装液量10 OmL,接种GF1菌株，3 7,2 2 0
7、rpm培养。取pH迅速下降期，即：6、8、1 0和12h发酵 液5 0 0 0 rpm离心10 min,所得上清液送山东农业大学化学院进行液相 色谱分析发酵液中乳酸、乙酸、丙酸和丁酸的含量。液相色谱条件：高效液相色 谱仪（美国Wat ers51 0型），检测器（美国Wat ers 2 4 8 7双波 长紫外检测器），色谱柱（美国Thermo Hypersil Gold a Q, 2 5 0 X 4. 6 mm, 5“m）, 流动相：5 0mmol/L磷酸二氢铵（磷调 pH=2 .5）：乙腈=98：2（V：V）流速：0 8mL/min, 柱温：28C，检测波长：212nm,进样量：10 “L。表
8、3 GF崗株发酵液儿种主要的仃饥酸分析Table 3()rganic acid analy 耳i廉 of GF1mg/ml.时问乳酸乙酸丁酸TimeLactic acidAcetic acidProp ionic acidButyric acid6 h0, 1490T 3550, 0120T 0198 h0T 0900. 3750, 0050, 02210 h0.1430. 4730, 02fi0, 02412 h0. 1340. 4950, 0230, 023方法二：L-乳酸（纯度为98%; CAS号:79-33-4;美国Sigm a公司）；柠檬酸（纯 度为 99. 5%; CAS 号:59
9、49-29-1）、乙酸（纯度为 99. 5%; CAS 号:64-19-7）、草 酸（纯度为99. 5%; CAS号:6153-56-6）（南京化学试剂有限公司）;反丁烯二酸 （富马酸）（纯度为99%; CAS 号: 110-17-8 ）、琥珀酸（纯度为99. 0%;CAS 号: 110-15-6 ）（国药集团）;葡萄糖（纯度为 99. 5%; CAS 号: 55-99-7 ）、D （ + ）- 木糖（纯度为 99. 0%; CAS 号: 58-86-7）（美国 Sigm a 公司）。色谱条件色谱柱：Bio-Rad Aminex HPX-87H 色谱柱（300 mm X 7. 8 mm,9 |
10、J m）;流动相:5 mmol/LH2SO4;流速:0. 6 mL/min;柱 温:55 C;检测器RID;进样量:10 p L;采用外标法定量。方法四文献：高效液相色谱法测定双歧杆菌的有机酸代谢产物有机酸：草酸、酒石酸、苹果酸、抗坏血酸、乳酸、冰乙酸、柠檬酸、丁 二酸（均为分析纯）。色谱条件色谱柱为C18柱5 J m,250X4.6 mm （i.d.,Phenomenex, USA）,进样体积:10 p I,流动相：甲醇，001mol / L NaH2PO4 溶液（1.0 mol / L磷酸调节pH值至28）。梯度洗脱程序：06 min 100% NaH2PO4缓冲液，615 min逐渐加入
11、甲醇，15 min时，甲醇、缓冲液比 例为5 : 95, 1520 min甲醇比例上升为45%, 2025 min保持甲醇比例为 45%,2526 min时甲醇比例为5%,27 min时为0%；前20 min检测波长为215 nm, 2025 min调整波长为254 nm, 2627 min为215 nm。流速 0.7 ml / min,柱温 25C。2.1.1流动相的选择流动相的pH对有机酸的分离有重要的影响，本实验分别配制pH值为4.0、3.5、3.0、2.8、2.6的0.01 mol / L NaH2PO4缓冲溶液，采用梯度洗脱程 序进行实验。结果表明，当pH值3.0时，苹果酸、乳酸、乙酸峰形不对 称；草酸、酒石酸无法分离；柠檬酸与抗坏血酸、乳酸色谱in2一2有机醴检测览杲2.2.1右机酸标推曲线检测图谱unci I IK ；1GOO :-r c u， F 600 T勺呃4 0 0-qoo -2Q0 rten 二11 T r r s f r p f r r i o i 33 斗 $6 r s & iaiiiji3ni5t/wln團2标准曲垓图厦注门苹酸2涵石継3苹果瞼斗扎験5匸菠6柠橡験7琥珀瞰
