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1、基质金属蛋白酶【关键词】 肠肿瘤；基质金属蛋白酶；肿瘤坏死因子受体Effects of matrix metalloproteinase9 on the expression of tumor necrosis factor receptor1 in human colon carcinoma cell lines【Abstract】 AIM: To study the effects of matrix metalloproteinase9 (MMP9) on the expression of tumor necrosis factor receptor1 (TNFR1) and migr
2、atory and invasive potentials in human colon carcinoma cells. METHODS: Immunofluorescence staining was applied to examine the expression of TNFR1 in SW1116 in human colon carcinoma cell lines. The expression of TNFR1 was assayed by flow cytometry in human colon carcinoma SW1116 cells treated with MM
3、P9 at different concentrations and at different time periods of culture. RESULTS: TNFR1 was expressed in SW1116 cells and MMP9 downregulated the expression of TNFR1 on cell surface in a dose and timedependent manner. CONCLUSION: MMP9 decreases the expression of TNFR1 on the surface of human colon ca
4、rcinoma cells， which may be a factor associated with invasive and metastasis potentials of colon carcinoma.【Keywords】 intestinal neoplasms; matrix metalloproteinase; TNFR【摘要】 目的： 研究基质金属蛋白酶9（MMP9）对大肠癌细胞肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）表达的影响以及促进大肠癌侵袭和转移的可能途径. 方法：通过免疫荧光法研究TNFR1在大肠癌细胞SW1116中的表达；用MMP9干预培养的大肠癌SW1116细胞，用流式
5、细胞术检测MMP9不同剂量和不同作用时间时TNFR1表达变化. 结果：SW1116细胞表达TNFR1; MMP9对SW1116细胞表面TNFR1表达有下调作用，但有剂量和时间依赖性. 结论： MMP9下调大肠癌细胞表面TNFR1的表达，可能与大肠癌侵袭转移密切相关.【关键词】 肠肿瘤；基质金属蛋白酶；肿瘤坏死因子受体0引言肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)是一种主要由单核巨噬细胞产生的多肽细胞因子，因其在内毒素处理后具有杀伤肿瘤细胞的作用而被命名为肿瘤坏死因子. TNF的生物学活性是通过存在于细胞表面的膜受体,即肿瘤坏死因子受体1(tumor necrosis
6、 factor receptor 1, TNFR1)和肿瘤坏死因子受体2(tumor necrosis factor receptor 2, TNFR2)介导. 体内外实验已证实肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptor, TNFR）介导肿瘤坏死因子的肿瘤杀伤作用，体内有多种免疫活性因子（干扰素、白介素等）即通过激活上调TNFR以达到清除肿瘤的目的1,因而诱导并稳定肿瘤细胞膜TNFR对机体抗肿瘤起非常重要的作用. 其他研究还证实大肠癌组织中存在基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）高表达或活性增强现象. 某些活性基质金属
7、蛋白酶可能通过酶解作用促进肿瘤细胞膜TNFR的释放形成高水平的可溶性肿瘤坏死因子受体2（soluble tumor necrosis factor receptor，sTNFR），是肿瘤细胞实现免疫逃逸的重要方式. 本研究通过检测TNFR1在肿瘤细胞膜的表达及MMP9对肿瘤细胞膜TNFR1表达的影响，探讨MMP9通过调节TNFR1促进大肠癌转移的可能机制.1材料和方法1.1材料大肠癌细胞株（SW1116）由南方医院消化科实验室保存；小牛血清（杭州四季青生物制品研究所）；RPMI1640培养液，青、链双抗，2.5 g/L胰酶（广州威佳生物试剂公司）；鼠抗人TNFR1单克隆抗体（Santa Cru
8、z公司）；FITC标记的羊抗鼠二抗（武汉博士德公司）；荧光素异硫氰酸盐（FITC）标记的鼠抗人TNFR1单克隆抗体及重组人MMP9购自美国RD公司；FITC标记的鼠IgG1对照抗体（北京鼎国生物有限公司）.1.2主要仪器倒置、相差显微镜（Olympas公司）；流式细胞仪（BECTON DICKINSON公司）.1.3方法1.3.1细胞培养大肠癌SW1116细胞株为贴壁生长细胞. 用RPMI1640培养基于25 cm2培养瓶,在37，饱和湿度、50 mL/L CO2培养箱中培养,培养基中含100 mL/L小牛血清，青、链霉素各100 U/mL. 汇片后弃培养液,用2.5 g/L胰酶消化细胞. 细
9、胞接种于25 cm2培养瓶，每3 d传代一次.1.3.2细胞爬片及免疫荧光染色SW1116细胞用2.5 g/L胰蛋白酶消化，用含100 mL/L小牛血清的RPMI1640培养液将细胞调成5104/mL的细胞悬液，接种于24孔板中，每孔预先置入6 mm6 mm盖玻片一张，待细胞生长状态良好时终止培养. 4 g/L多聚甲醛固定爬片30 min后0.1 mL/L PBS冲洗，用10 mL/L Triton X100处理15 min后正常羊血清37孵育30 min，甩去血清. 滴加150稀释的鼠抗人TNFR1单克隆抗体，4湿盒过夜后滴加1100稀释的FITC标记的羊抗鼠二抗，37孵育1 h，用蒸馏水振
10、洗后无荧光缓冲甘油封片. 阴性对照用PBS代替一抗进行染色. TNFR1阳性表达细胞在荧光显微镜下发出绿色荧光.1.3.3干预实验人SW1116大肠癌细胞以2105/mL接种于24孔板，用含100 mL/L小牛血清RPMI1640培养基在37，50 mL/L CO2培养箱中培养12 h使细胞吸附在培养板上换用无血清培养基继续培养24 h后加入MMP9进行干预，分组如下：MMP9 0 ng/mL（A组）；MMP9 154 ng/mL（B组）；MMP9 385 ng/mL（C组）；MMP9 770 ng/mL（D组）；MMP9 1155 ng/mL（E组），干预3 h；然后在MMP9为770 ng
11、/mL的浓度下，分别作用0，1.5，3，6和9 h.1.3.4流式细胞仪检测大肠癌SW1116细胞TNFR1的表达采用直接免疫荧光标记法 培养细胞制成单细胞悬液并计数，实验管取20 L单细胞悬液（含1105细胞）与10 L FITC标记的鼠抗人TNFR1单克隆抗体，对照管加入相应无关鼠对照单抗10 L在4共育45 min，用含5 g/L BSA的等渗PBS缓冲液洗涤细胞两次后弃上清，然后加入400 L 4 g/L的多聚甲醛于4固定30 min，即上机检测. 每份样品测定10 000个细胞，计算细胞表达TNFR1的百分率.统计学处理：各实验独立重复3次，应用SPSS 10.0统计软件. 数据用x
12、s表示，采用单因素方差分析和Dunnettt检验的两两比较，P<0.05为有统计学差异.2结果2.1免疫荧光染色结果TNFR1在SW1116细胞膜呈较强荧光，对照组无表达(图1).A: SW1116细胞； B:阴性对照.图1TNFR1在SW1116细胞的表达2.2不同浓度MMP9作用后对TNFR1表达的影响流式细胞检测结果显示，在不同的浓度作用3 h后，与MMP9 0 ng/mL组(表达率90.92%)比较，MMP9 770 ng/mL组（表达率69.96%），MMP9 1155 ng/mL组(表达率65.06%) TNFR1表达水平明显降低（P<0.05）；MMP9 154 ng
13、/mL组（表达率85.05%），MMP9 385 ng/mL组(表达率87.54%)与MMP9 0 ng/mL组相似（P>0.05）；MMP9 154 ng/mL组与MMP9 385 ng/mL组TNFR1表达水平明显高于MMP9 770 ng/mL和MMP9 1155 ng/mL组（P<0.05）；MMP9 154 ng/mL组与MMP9 385 ng/mL组TNFR1表达水平相似（P>0.05）；MMP9 770 ng/mL组和MMP9 1155 ng/mL间TNFR1表达水平相似（P>0.05，图2）.2.2MMP9作用不同时间后对TNFR1表达的影响在MMP9
14、770 ng/mL浓度，不同作用时间条件下，与0 h组（表达率86.36%）比较，3 h（表达率67.68%），6 h（表达率18.08%），9 h（表达率14.38%）组TNFR1水平明显降低（P<0.05）；1.5 h（表达率83.88%）组与0 h组TNFR1水平相似（P>0.05）；3 h组TNFR1水平明显高于6 h和9 h组（P<0.05）；6 h组与9 h组TNFR1水平相似（P>0.05，图3）.aP<0.05 vs A.3讨论TNF在体内外对多种肿瘤细胞具有杀伤作用，人们曾对TNF治疗肿瘤寄予很大希望. 但由于它在治疗肿瘤的同时,也对机体产生极其
15、严重的毒副反应,从而影响了它在临床上的广泛应用. TNF的生物学作用是由二种不同的受体TNFR1（P55）和TNFR2（P75）介导的. TNF的许多效应是通过TNFR1起作用,TNFR2则起着信号传导作用. Chen等3报道，TNFR1可通过其死亡域寡聚TRADD，FADD分子,激活MACH/FLICE,启动caspase级联放大效应途径而诱导细胞凋亡. 因此TNFR1在多种恶性肿瘤中呈高表达. 本研究显示在大肠癌细胞株表面存在TNFR1的高表达. 另据文献4报道,在大肠癌组织中TNFR1的表达显著高于癌旁及正常组织,与浆膜浸润程度和淋巴结转移呈负相关；日本学者于2003年报道了大肠癌Dukes C期患者TNFR1高表达者的疾病特异性存活率明显高于低表达者，多因素分析表明TNFR1表达是一种独立的大肠癌预后预测因子5. 在胆囊癌中,癌细胞及黏膜上皮细胞几乎无TNFR1的表达,而间质中浸润的单核细胞和血管内皮细胞中可明显见受体表达6，这说明TNFR1在肿瘤形成及发展过程中起重要作用,且通过不同途径介导TNF的生物学效应. 有研究发现阻断TNFR1可引起胞内凋亡抑制蛋白（FLIP）的上调，进而抑制细胞凋亡；而阻断 TNFR2 可引起 FLIP 的下调进而促进细胞凋亡7推测TNFR的功能,一是作为载体内化TNF,二是激活特定的细胞内部信号传导途径. 有人认为TNF与其受体
