第十六章 标记抗体技术

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1、第十六章 标记抗体技术1、免疫荧光标记技术的概念 /所用荧光素的要求 /基本原理 /操作步 骤/注意事项/实际应用（一）概念：免疫荧光标记技术是指用荧光素对抗体或抗原进行标记， 然后用荧光显微镜观察荧光以分析示踪相应的抗原或抗体的方法（二）荧光素要求：作为蛋白质标记用的荧光素须具备 有与蛋白 质分子形成稳定共价键的化学基团，而不形成有害产物 荧光效率 高，与蛋白质结合的需要量很小结合物一般在储存条件下稳定， 结合后不影响抗体的免疫活性作为组织学标记，结合物的荧光必 须与组织的自发荧光有良好的反衬，以便能清晰地判断结果 结合 程序简单，能制成直接应用的商品，可长期保存。可用于标记的荧光 素有FI

2、TC,RB200,四甲基异硫氰酸罗丹明。-件为标记蔬光素需椭足的条件；（1）有与蛋1分子形成穗定共价键的化学基团.且不形成有嘗产物.C2）荧光效军高.与蛋白结合的需要垦小.（3）标记后不欝响抗体的洒性（4）怖质稔定，易保秤（5）谶发的荧光与背景颜色有良好的反差-标记简单.能花成商品（三）基本原理：将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反 应（四）操作步骤：标本制备： 涂片或压印片：细菌培养物、感染动物的组织或血液、脓汁、粪便、 尿沉渣冰冻切片或低温石蜡切片：组织学、细胞学和感染组织 盖玻片：上面培养单层细胞 首要要求是保持抗原的完整性，并尽可能减少形态变化，抗原位置保 持不变。标本要相当薄

3、，有适当的固定处理方法 固定：常用丙酮和95%乙醇，室温固定15-30min后，用PBS反复 冲洗，干后即可染色。目的：防止被检材料从玻片上脱落，消除抑制抗原抗体反应的因素。 检测细胞内的抗原，用有机溶剂固定可增加细胞膜的通透性而有利于 荧光抗体渗入。 检测：A、直接法：直接滴加2-4个单位的标记抗体于标本区，置湿盒中，于37度染色30min左右，然后置大量ph7-7.2PBS中漂洗15min，干 燥、封载，显微镜镜检B、间接法：将标本先滴加特异性的抗血清，置湿盒中，于37度作用30min, PBS漂洗5min后，再加入FITC标记的抗抗体，置湿盒中，37 度作用30min，PBS漂洗5min

4、，干燥、封载，显微镜观察(3)集色方法有直接迭和间按法两种宜接姑；A在标本上滴加加舲单位的标记抗休、置湿盒 中，37C作用30H1HB在犬量PBS中漂15min.D封诚商加緩冲甘油.用益跋片封養 检测中.要设阳性、阴性标本对照 缓冲甘油：分析纯甘油驸加FBS1份直接弦猪链竦菌理MRF的雅宦r措链球曲2型肉汤培养物涂片 s-r-B PBS漂洗 5 minC拥人FTP茴工的抗MRP抗怵，理視盒中,冬尹C作用30 mnD PBS漑洗5 ninE干燥、封载M间接法（如检测猪淋巴结甲ffiSFVA在标本上滴抑抗SFV血清.置湿盒中.37C祚用30 minB PBS臟 5 mittC抑FITG标记的抗抗体

5、.置湿盒中，歹C作用30 minD PBS漂恍E干燥、封載（五）注意事项： 由于荧光容易淬灭，一般仅能维持几个小时，因此，荧光二抗应 避光保存，即从加入荧光二抗以后的步骤中都要尽量避光操作。封片 后应尽早照相，目前有市售的荧光增强剂，可使荧光在4 度保存1-2 周仍不淬灭 常用的荧光素有以下几种：绿色荧光：FITC,Alexa Fluor488和GFP； 红色荧光：TRITC,Cy3, Alexa fluor568&594 和 MitoTrackerRed；蓝色荧 光：Hoechst, DAPI；黄色荧光：YFP,Fuo-3 和 Rhoda-mine123 不同的荧光素激发的波长不同，因此，选

6、用滤光片时要注意。一般紫外线的激发波长为334-365nm，蓝光的激发波长为435-490nm，绿光的激发波长为546nm左右 荧光显微镜应提前至少15min打开汞灯预热，关闭30min后方可再开启 免疫荧光的组织要求很高，载玻片即盖玻片要干净无杂质（六）实际应用：(1)细菌学诊断可直挽楡測威鹿定新井离的细SL具育 较髙的敏感性和特异性-动物粪便.黏膜拭子涂片、病变组织触 片或切片、尿沉渣等均可作为样本对含菌少的样半，可采用滤膜聚曲迟 擁后在滝膜上竝行免疫蔬光染酋(2)病毒病诊断出接检側病变齟垠巾的病弗是病奇炳燼 断的常用手段.如猪温.禺件支猪流行性腹泻和传染性冒肠炎，临床症状 相似，但将猪小

7、肠做切片.即可区分对于诸瘟等不出现细脳病变的病毒卜免疫 荧光可作为病毒增殖的指征(3其地应用免疫黄光广抚应用于淋巴细胞CD分子和般表 面免疫球蛋白的检测.用于淋巴细脳的分型； 借助于流式细廳计数技术，可以评价机体细胞 免蛙忧良如咗捌刺徼机怵细起免疫功憶增加, 可通过檢上的口玻达虽来連真2、放射免疫分析的概念/所用放射性元素要求/基本原理/操作步骤/注意事项/实际应用(一) 概念：是将放射性同位素测量的高度敏感性和抗原抗体反应的 高度特异性结合起来而建立的一种免疫分析技术(二) 放射性元素的要求：低序号的常见元素，便于置换化合物 中的同种元素进行标记放射强度低或中等，降低对操作人员的危 害半衰期

8、适中，既能保持检测时间，又便于环境中的处理。常用 3H,125I,32P,35S(三) 基本原理：i1竞爭性RS原理定屋分析微呈半抗原物质肉采用谏窜.同时在溶液中加入标记抗原,非栃记 抗原(Ag)和拭怵(Ab),使未刖与Ag竞争性 竝习AWS角 根甥免疫沉淀物中判Ab醐 减少来测定Ag的J-*Ag+Ab . Ag-AbAgAg-Ab当反应休系中祁在一定星的刃均和Ab时, 帝合型*Ag-Ab(B)和游离型冲Ag怕 的It例是 一定的.他们傑持着可逆的动态平衛.在此反应液中加入待检的Ag则诈啊磧争地与昭合蛭的呈越埶 吕疔的比 值或B晰越小.因此，只要把反应液中的咏F分开，然后 分别测定陋附放射性，

9、即可计算出日疔值和 结合百分率.用已知浓度的标准物Ag）和一定量的 槪即、Ab反应.测出不同浓度尊下的吕尸，以 标懂物的浓度为横坐标.以创F为纵坐标.即 可绘制竞争性抑制反应曲线.实验中.测出待检抗原的囱E即可在标 雀曲线上查出其含量.2固相夹心RIA与夹心HJSA的原理相镇.以一定量的 抗体包被良应皆.耕后拥人紊列稀释的祥检 抗原.最后加人放射性同位素标记的抗体. 计数结果.根据标准样品制备的标准曲线进 行宦JS閒遣.弑貝跪检測完金抗原四）操作步骤 液相放射免疫测定（放免通常指液相法） 试验基本过程：（1）适量处理待测样品（2）按一定要求加样，使待测抗原与标记抗原竞相与抗体结合（3）反应平衡

10、后，加入分离剂，将B和F分开（4）分别测定B和F的脉冲数（5）计算B/F值或B%，在标准曲线上查待测抗原的量2 加样与反应有平衡饱和法和顺序饱和法平衡饱和法：将已知量的标记抗原*Ag和待测抗原相结合，然后加入 抗血清（Ab），孵育一段时间，使反应达到平衡。顺序饱和法：将待测抗原与限量抗血清混合，孵育一段时间后，再将 标记抗原加入。因本法中待测Ag优先与Ab结合，故更敏感。 顺序饱和法：标记抗原的量应按制作标准曲线的量加入。抗血清应稀释 成能结合 50%标准抗原的稀释度。孵育时间按不同检测物而异，一般 用4C24h。建立方法时应优化检测条件。3 分离与测定（1）吸附法 活性炭表面吸附蛋白时，就不

11、能吸附大分子抗原抗体 复合物，只能吸附游离的F。离心，就可以将B与F分离。（2） 化学沉淀法PEG （聚乙二醇）可以将B沉淀，从而将B与F 分离。（3）双抗体沉淀法：在反应液中加入一定的抗抗体，即可将 B 沉淀 下来。（五）注意事项（1）编号：第一排是标准管：根据标准品浓度由低到高A ,B,C, D,E,F,G；第二排是被测样品1,2,3,4,5,6,。（2）加样要准确，移液器的使用（两个档位，一档吸人，二档排出） 吸头（一个标本一个吸头，避免互相污染）。加试剂：先看瓶签，再 摇匀，最后吸人。（标记物一般为红色，一抗为兰色）。（3）温育时间要保证：按说明书中所要求的时间温育，可以延长， 不能缩

12、短。（4）分离剂加入：混匀静置时间，可以延长，不能缩短。保证抗原 抗体复合物与第二抗体的充分结合。（5）温度：注意观察水浴箱的水温，误差不能太大，为1弋，室 温21C左右。（ 6 ）离心时间：也应按说明书中所要求来操作，转速一般为3 500r/mi n。往离心机里放反应管时，尽量让它直立（因为倾斜可能 会使液体流出）。吸上清液时，沉淀物在试管底部，真空泵的吸头头 部不能直接插人到试管底部中央（会吸走沉淀物，而我们的目的是分 离保留沉淀物），应该使吸头贴着试管管壁往下放，并且试管要稍微 倾斜，但要在即将插到沉淀物边缘时停止，快速上升取出。少留一点 点上清液也可。主要是保证沉淀物完整。（7）进人免

13、疫计数器测量时，注意观察做出的曲线好坏：是不是需 要修改，剔除坏点。（8）报结果：碰到异常结果，要再次看一看沉淀物是否都在，患者 情况如何，吉果是否与患者情况相符方可报出。非竞争性RIA法中， 清洗固相包被珠时，清洗次数要严格按说明书中所要求来操作，不得 减少。虽然RIA法的影响因素很多，但操作中只要注意上述事项，RIA法的稳定性还是相当不错的。主要是它存在放射污染，这个问题 不易解决，影响了它以后的发展，如今电化学发光免疫分析，化学发 光免疫分析，酶联免疫分析，磁酶免疫分析等相继推出，发展很快。 RIA法将被淘汰。（六）实际应用 疾病的诊治：诊断传染病、寄生虫病，还广泛应用于各种内分泌 疾病

14、、心血管疾病和肿瘤疾病的诊断。直接检测外周血中甲状腺激素 T3T4 的浓度，测定血清中肌红蛋白的浓度，早期诊断和治疗心肌梗 塞。对于肿瘤的诊断，用以诊断肝癌的甲胎蛋白 激素等微量活性物质的测定 测定促甲状腺激素和促甲状腺释放激素的弄得 药物检测：检测中毒或用药过量，运动员获得的最佳成绩是否因 为服用兴奋剂3、免疫酶标记技术常见试验方法有哪些/试验原理 直接法：以酶标抗体处理标本，然后浸于含有相应底物和显色剂的反应液中，通过显色反应检测抗原抗体复合物的存在 间接法：标本用相应的特异性抗体处理后，再加酶标记的抗抗体， 然后经显色揭示抗原-抗体-抗抗体复合物的存在 抗抗体搭桥法：利用抗抗体既能与反应

15、系统的抗体结合，又能与 抗酶抗体结合(抗酶抗体与针对抗原的抗体必须是同源的)特性，以 抗抗体作桥连接抗体和抗酶抗体。先加抗体使与标本上的抗原发生特 异性结合，然后加抗抗体与抗体结合，再加既能与抗抗体结合又能与 酶结合的兔抗酶抗体，最后用底物显色。 酶抗酶复合物法：PAP法。将HRP和抗HRP抗体结合形成酶抗酶 抗体复合物PAP，用PAP来代替抗抗体搭桥法中的抗酶抗体和酶。 杂交抗体法： 增效抗体法：4、酶联免疫吸附试验 ELISA 的各类型试验原理/试验方法/注意事项/ 结果判定方法/试验检测用途/各自区别(一) 各类型试验步骤间接法：用于测抗体(如测AIV抗体)(1)AIV病毒包被( 2 )洗涤 35 次，每次 35min(3)封闭 含 1%0VA 的 PBS (pH7.2，浓度为 10mmol)( 4 )洗涤 同上(5)加待检抗体，置湿盒中，37C作用12h( 6 )洗涤 同上(7) 加酶标记抗抗体，置湿盒中，37C作用12h(8) 加底物显色，测0D值 直接法：用于测抗原(如沙门氏菌)(1) 待检抗