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1、细胞的复苏点击次数：1064发布时间：2010-6-4细胞的复苏细胞复苏的原则一快速融化：必须将冻存在-196C液氮中的细胞快速融化至37，使细胞外 冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。一. 实验前准备：1. 将水浴锅预热至37C2. 用75%酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。3. 在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。二. 取出冻存管：1. 根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。2. 从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。三. 迅速解冻：1. 迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不
2、断的摇动，使管中的液体迅速 融化。2. 约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。四. 平衡离心：用架盘天平平衡后，放入离心机中3000r/min离心3min五. 制备细胞悬液：1. 吸弃上清液。2. 向离心管内加入10ml培养液，吹打制成细胞悬液。六. 细胞计数：细胞浓度以5X105/ml为宜。七. 培养细胞：将复合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37C5%CO2的培养箱内2-4 小时（或者24-48小时）后换液继续培养培养，换液的时间由细胞情况而定。初学者易犯错误：1水浴锅未预热或者未预热到37Co2. 水浴锅内冻存管太多，导致
3、传热不佳，使融化时间延长。3. 离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。4. 一次复苏细胞过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。细胞复苏步骤注意事项：【材料】1. 常规细胞培养仪器设备恒温水浴振荡器。2. 培养液（DMEM）胎牛血清（CBS）二甲基亚砜（DMSO）【操作程序】1. 细胞实验室进行常规消毒，紫外照射40min以上。2. 培养液（DMEM）、0.25%胰蛋白酶（Trypsin）恒温水浴箱370C预热20min，备用。3. 二甲基亚砜（DMSO）在40C冰箱中冷藏30min，备用。4. 从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入400C水浴中，快速摇晃，直至冻存液完全融化。5. 将细
4、胞悬液移入15ml离心管，缓慢加入4ml培养液，离心（1000r/min，5min）。6. 用培养液悬液混悬沉淀细胞，调整细胞浓度，方培养箱中培养。7. 记录复苏日期。【注意事项】1. 取细胞的过程中注意带好防冻手套，护目镜。此项尤为重要，细胞冻存管可能漏入液氮， 解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。2. 冻存液的问题：冻存液的配置已是常识，在这里不作详述，但二甲基亚砜（DMSO）对 细胞不是完全无毒副作用，在常温下，二甲基亚砜对细胞的毒副作 较大，因此，必须在1-2min 内使冻存液完全融化。如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤，二甲基亚砜DMSO）最好 选择进口产品。3. 离心前须加入
5、少量培养液。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，注意加入少量培养液可稀 释其浓度，以减少对细胞的损伤。4. 离心问题：目前主要有两种见解。一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养 瓶中进行培养，第二天换液。因为离心的目的是两个，去除DMSO，去除死细胞，这个是 标准流程，但对一般人来说，把握不好离心转速和时间，转的不够活细胞沉底的少，细胞就 全被扔掉了，转过了活细胞会受压过大，死亡。此外在操作过程中容易污染，所以不推荐。 另一种说法为细胞悬液中含有二甲基亚砜（DMSO），DMSO对细胞有一定的毒副作用，所 以须将离心后的液体前倒净，且一定倒干净。我在试验中按照常规的离心分装的方法进行 复苏，结
6、果无有异常。5. 细胞贴壁少的问题：教科书中说明冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml15m培养液， 而在我的试验中的经验总结为培养基越少细胞越容易贴附。6. 复苏细胞分装的问题：试验中我的经验总结为复苏1管细胞一般可分装到1-2只培养瓶 中，分装过多，细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁。7. 加培养基的量放入问题：这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度，从 如果你加培养基的太少，那么DMSO的浓度就会比较大，就会影响细胞生长，从以前的资 料来看，DMSO的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没有什么影响，还有一个说法是1%。 所以如果你的冻存液的浓度是10%DMSO的话那么加10ml以
7、上的培养基就恰好稀释到了 无害浓度。一、原理在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机 械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养 液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存 在一130C以下的低温中能减少冰晶的形成。细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的一50C，细胞仍能生长，活力受损不大。 目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易 穿透细胞。二、操作步骤（一）冻存1、消化细胞（同实验二），将细胞悬液收集至离心管中
8、。2、1000rpm离心10分钟，弃上清液。3、沉淀加含保护液的培养，计数，调整至5x106/ml左右。4、将悬液分至冻存管中，每管1 ml。5、将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。6、贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。7、按下列顺序降温：室温一4C（20分钟）一冰箱冷冻室（30分钟）一低温冰箱（一30C 1 小时）一气态氮（30分钟）一液氮。注意：操作时应小心，以免液氮冻伤。液氮定期检查，随时补充，绝对不能挥发干净，一般30 立升的液氮能用11.5月。（二）复苏1、准备一个茶缸或1000ml的烧坏，内装2/3杯37C的温水。2、从液氮中取出冻存管、迅速置于温水中并不断搅动。使冻存管中的冻存物在1分钟之内融化。3、打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。4、1000rpm离心10分钟，弃去上清液。5、沉淀加10ml培养液，吹打均匀，再离心10分钟，弃上清液。6、加适当培养基后将细胞转移至培养瓶中，37C培养，第二天观察生长情况。三、试剂和器材器材：液氮罐、冻存管（塑料螺口专用冻存管或安瓿瓶）、离心管、吸管、离心机等试剂：0.25%胰酶、培养基、含保护剂的培养基（即冻存液）附：冻存液配制：培养基加入甘油或DSMO，使其终浓度达5-20%。保护剂的种类和用量视不同细胞而不同。 配好后4C下保存。
